1、1临床检验基础学实验指导血液常规检验一、微量吸管的使用、毛细血管采血、计数板的鉴定与使用【实验目的】：掌握微量吸管的使用、毛细血管采血、计数板的鉴定、构造与使用。【实验试剂】：红细胞稀释液、75乙醇、消毒药棉。【实验器材】： 一次性采血针、计数板、盖玻片、微量吸管、2ml 吸管、中号试管、显微镜、小玻璃棒。【实验原理】：一次性采血针刺破毛细血管后，用微量吸管吸取一定量的血液，稀释一定的倍数，冲入计数池计数一定体积内的细胞的数量。【实验方法】：一、微量吸管的使用：用抗凝血训练微量吸管的使用。二、毛细血管采血（以红细胞计数为例）：准备：取清洁干燥试管一支，加 2ml 红细胞稀释液。采血部位选择、按
2、摩75乙醇棉球进行刺针部位皮肤消毒待酒精挥发干（否则血流不成滴）自指尖腹内侧迅速刺针擦去第一滴血准确吸取 10ul 血液用无菌干棉球压住伤口止血用无菌干棉球擦去管尖外围余血后将血液释放到稀释液底部回吸上清液 2-3 次轻轻混匀。三、计数板构造与应用1计数板构造外观构造：每块计数板由“H”型凹槽分上下两个计数室，在计数室两侧各有一条支柱，比计数室高出 0.1mm，将一块平整光滑的血细胞计数专用盖玻片（24.0mm20.0mm0.6mm）覆盖其上时，盖玻片与计数室间形成0.1mm 的缝隙。2格子构造：计数池长、宽各 3mm，平均分成 9 个大格，每个大方格的容积是 0.1 mm3四角的四个大方格分
3、别用单线划分成 16 个中方格，是白细胞计数区域；中央的大方格用双线条划分成 25 个中方格，每个中方格又用单线划分成 16 个小方格，其中四角和正中的 5 个中方格是红细胞计数区域。2计数板的使用： 用清洁干燥柔软的纱布擦拭计数板及盖玻片用推盖法从计数板下缘向前平推盖玻片将其盖在计数室上充分混匀细胞悬液充池静置观察细胞分布情况（若严重不匀，应重新充池。）【注意事项】：1采血部位应选择皮肤完整，不能有烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症。2针刺应迅速，深度适宜（约 23mm）。待血液自行流出，擦去第一滴血。3微量吸管取血时应将微量吸管管尖侧着插入血滴中央。若血流不暢，可以左手自采血部位远端向指尖稍压力
4、至血液流出为止。切忌用力挤压，造成组织液混入，影响结果准确性。4计数板在使用中勿让手指接触计数池及盖玻片表面，以访油腻污染，致使充液时起泡。二、血涂片的制作,瑞氏染色【实验目的】：掌握血片制作方法，瑞氏染色原理及方法。【实验试剂】：瑞吉氏复合染液 （液、液）【实验器材】：显微镜、载玻片、推玻片、一次性针头、消毒棉球、洗耳球3【实验原理】：细胞的着色既有化学的亲和作用，又有物理的吸附作用，不同的细胞由于其所含化学成分不一样，化学性质各不相同，所以对染料的亲和力也不一样，因此将细胞染成不同的颜色。【实验方法】：一、瑞一吉氏复合染液配制液：取瑞特染粉 1g，吉姆萨染粉 0.3g，置洁净研钵中，加少量
5、甲醇（分析纯），研磨片刻，吸出上层染液，再加少量甲醇，继续研磨，再吸出上层染液。如此连续几次，共用甲醇 500ml。收集于棕色瓶中，每天早晚各振摇 3共 5 天，再存放一周，将染液过滤后即可使用。液：磷酸盐缓冲液（PH6.56.8），取磷酸二氧钾（无水）6.64g，磷酸氟二钠（无水）2.56g，加少量蒸馏水溶解，调整 PH 后，加水至1000ml。二、血片制作、瑞氏染色方法准备：取清洁干燥载玻片，边缘光滑清洁推玻片各一张。1、制备血涂片：取载玻片取血 1 滴于载玻片右端（边缘留 1.5cm空隙）左手持载玻片，右手持推玻片将推玻片放至血滴前沿逐渐后移至血滴沿推片散开后，推玻片与载玻片成 3035
6、的夹角以平稳的速度将血液向前推进干燥（手持载玻片末端迅速在空气中挥动干燥）。2、染色：将干透的血涂片放在水平位置加瑞吉氏复合染液液数滴，以染液覆盖整个血膜为度静置染 0.51min滴加约 2 倍于液量的液用洗耳球吹气混匀染色 510min平持玻片用流线型水洗干燥镜检【注意事项】：1严格皮肤消毒。2.血滴大、血黏度高、推片角度大、速度快则血膜厚，反之则血膜薄。43.染料放置时间越长，美兰逐渐氧化为天青，染色效果越好。4染液淡，室温低，细胞多则染色时间长，反之减少染色时间。5水洗方法为平持血涂片流线型水缓缓冲洗干净，不要先倒掉染液。三、白细胞计数（WBC）【实验目的】：掌握白细胞计数的原理、操作方
7、法与结果报告。【实验原理】：用白细胞稀释液将全血稀释一定的倍数并破坏红细胞，充入血细胞计数池，显微镜下计数一定体积的白细胞数，经换算求出每升血液中的白细胞数量。【实验试剂】：白细胞稀释液 【实验器材】： 显微镜、改良 Neubauer 计数板、试管、微量吸管、玻璃棒【实验方法】：准备：取清洁干燥试管一支，加 0.38ml 白细胞稀释液。采血部位按摩75乙醇棉球进行刺针部位皮肤消毒待酒精挥发干（否则血流不成滴）自指尖腹内侧迅速刺针擦去第一滴血准确吸取20ul 血液用无菌干棉球压住伤口止血用无菌干棉球擦去管尖外围余血后将血液轻轻释放到稀释液底部回吸上清液 2-3 次混匀室温静置至液体变为棕褐色即红
8、细胞破坏完全清洁计数板、盖玻片充池静置23min 待细胞下沉低倍镜下计数四角大方格内的白细胞总数计算报告。计算：WBC=四个大方格内的白细胞数（N）/41020106=N/20109/L5【注意事项】：1采血部位应选择皮肤完整，不能有烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症。2针刺应迅速，深度适宜（约 23mm）。待血液自行流出，擦去第一滴血。3.稀释液要过滤使用，试管、计数板均须清洁，以免混入杂质被误认为白细胞。4.加稀释液、血液量应精确，以保证稀释倍数。5.计数池内细胞分布要均匀，每个大方格间白细胞数差异不得超过均值的10，否则要重新充液计数。6.严格掌握计数原则，以免人为扩大或缩小计数区域。7.白细
9、胞数量过高时，可加大稀释倍数，反之白细胞过低时可计数 8个大方格内白细胞数或加大取血量。四、白细胞分类计数（DC）【实验目的】：掌握显微镜法外周血分类计数的方法、各种白细胞的镜下形态。【实验原理】：将血液制备成涂片，经瑞吉氏染色后显微镜下根据白细胞的形态特征进行分类计数。通常分类 100 个白细胞，计算得出各种白细胞所占百分比。【实验试剂】：瑞吉氏复合染液 【实验器材】：显微镜、外周血标本片、香柏油、擦镜纸、清洁剂【实验方法】：准备：血涂片制备及瑞吉氏染色待干低倍镜下选择细胞分布均匀、着色良好的区域转油镜按一定的规律移动视野，依次进行分类计够 100 个白细胞算出各种白细胞的百分比报告6【注意
10、事项】：1.涂片制备要厚薄适中、均匀、头体尾分明。2.分类时要有程序地连续进行，避免主观选择视野。3.分类中如见幼红细胞，不计入 100 个白细胞内，以分类 100 个白细胞过程中见到幼红细胞多少个来报告，并应注明其所属阶段，4.分类中应注意观察成熟红细胞、血小板的形态染色及其分布情况，注意有无寄生虫（如疟原虫）及其他异常所见。五、白细胞计数（WBC）及分类计数(DC)【实验目的】：掌握白细胞计数及分类计数原理、方法与结果报告【实验原理】：白细胞计数原理：用白细胞稀释液将全血稀释一定的倍数并破坏红细胞，充入血细胞计数池，显微镜下计数一定体积的白细胞数，经换算求出每升血液中的白细胞数量。白细胞分
11、类计数原理：将血液制备成涂片，经瑞吉氏染色后显微镜下根据白细胞的形态特征进行分类计数。通常分类 100 个白细胞，计算得出各种白细胞所占百分比。【实验试剂】：白细胞稀释液、瑞吉氏复合染液【实验器材】：显微镜、改良 Neubauer 计数板、试管、微量吸管、玻璃棒、载玻片、推玻片、香柏油、擦镜纸、清洁剂【实验方法】：准备：1.取清洁干燥试管一支，加 0.38ml 白细胞稀释液。2.取清洁干燥载玻片，边缘光滑清洁推玻片各一张。7采血部位按摩75乙醇棉球进行刺针部位皮肤消毒待酒精挥发干（否则血流不成滴）自指尖腹内侧迅速刺针擦去第一滴血准确吸取20ul 血液用无菌干棉球擦去管尖外围余血后将血液轻轻释放
12、到稀释液底部回吸上清液 2-3 次混匀另取血一滴于载玻片的右端立即推制血膜用无菌干棉球压住伤口止血清洁计数板、盖玻片充池（静置23min 待细胞下沉）低倍镜下计数四角大方格内的白细胞总数将干透的血膜进行瑞吉氏染色油镜下分类计数计算报告。六、红细胞计数（RBC）、Hb 测定【实验目的】：掌握红细胞计数，Hb 测定原理、操作方法，规范的报告结果【实验原理】：红细胞计数原理：用等滲稀释液将血液稀释一滴倍数，充入计数池，在显微镜下计数一定体积内的红细胞数，经换算求得内升血液中的红细胞数。Hb 测定（HiCN 法）原理：血红蛋白被高铁氰化钾氧化为高铁血红蛋白，后者再与氰离子结合形成稳定地氰化搞铁血红蛋白
13、（HiCN），HiCN 在规定波长（540nm）和液层厚度（1cm）的条件下具有一定的毫摩尔消光系数。可用标准的高精度分光光度计进行直接定量测定，或用 HiCN 标准液进行比色法测定，根据标本的吸光度即可求出血红蛋白浓度。【实验试剂】：红细胞稀释液（甲醛枸木缘酸盐稀释液）， HiCN 转化液【实验器材】：改良 Neubauer 计数板、显微镜、分光光度计、玻璃试管、微量吸管、玻璃棒、【实验方法】：8RBC：取清洁干燥试管一支加红细胞稀释液 1.99ml加未梢血10ul 于稀释液底部吸取上清液嗽洗 34 次颠倒混匀清洁计数板，盖玻片充液静置 23计数（中央大格中四角及正中 5 个方各细胞数）计算
14、RBC=5 个中方格细胞数51020010 6=5 个中方格细胞数1012/L。Hb 测定:1.直接定量测定法：取中号试管一支加 HiCN 转化液 5ml加未梢血20ul混匀静置 5721 比色，波长 540nm，以转化液为空白对照管测其吸光度“A”计算（“A”367.7）报告2.标准曲线法：将血红蛋白标准液稀释成不同的三种浓度（150g/L、100g/L、50g/L）分别测其吸光度“A”，以“A”为纵坐标，血红蛋白标准液参考值（g/L）为横坐标，绘制标准曲线。通过标准曲线查出待测样本的血红蛋白浓度。【注意事项】：1.取血应顺利、准确，采血部位不得有烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症，不得过渡挤压，
15、红细胞数量明显增高者可适当加大稀释倍数。2. HiCN 转化液应置棕色瓶于 4冰箱中，不能储存于白色瓶、塑料瓶及强光下，否则会使 CN 丢失，结果偏低。3HiCN 转化液中有氧化钾剧毒，防止污染。测定后的比色液不能与酸性溶液混合，否则可产生剧毒的氢氰酸气体。4.所用分光光度计的波长、吸光度需要校正，带宽应小于 1nm，比色杯光径 1.000cm 时，测定温度为 2025。七、血液常规检验9【实验目的】：掌握血常规的连续操作规程并规范的报告结果。【实验原理】：见实验二、三、四、六【实验试剂】：红细胞稀释液、白细胞稀释液、瑞吉氏复合染液、HiCN转化液【实验器材】：改良 Neubauer 计数板、
16、分光光度计、玻璃试管、微量吸管、显微镜、玻棒。【实验方法】：取大、中、小号试管各一支分别加 HiCN 转化液 5ml、红细胞稀释液2ml、白细胞稀释液 0.38ml手指消毒针刺分别取未梢血 10ul 于红细胞稀释液中、20ul 于白细胞稀释液中、20ul 于 HiCN 转化液中 并及时混匀取清洁干燥玻片粘取 1 滴血液于玻片一端推制血片 待干721 比色瑞氏染色白细胞及红细胞计数DC计算报告（血常规结果报告）正常值：成人 儿童 新生儿1.WBC:（410）109/L （512）109/L （1520）109/L成年男性 成年女性 儿童2.RBC:（45.5）1012/L (3.5-5) 101
17、2/L (6-7) 1012/L3.HB: 120-165g/L 110-150 g/L 170-200 g/L4.DC: N: 杆状 15分叶 5070L：2040 M：38 E：0.55 B：01【注意事项】：1.取血应顺利、准确，采血部位不得有烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症，不得过度挤压。102HiCN 转化液中有氧化钾巨毒，防止污染。测定后的比色液不能与酸性溶液混合，否则可产生剧毒的氢氰酸气体。3细胞计数混合不易过分震摇。4. 瑞氏染色时加染液与缓冲液的比例为 1：1 或 1：2。5.采取标本的顺序：红细胞计数、血红蛋白测定、白细胞计数、血片制作八、血小板计数（BPC 或 PLT）【实验
18、目的】：掌握血小板的计数原理、方法、镜下形态及结果报告。【实验原理】：用稀释液将血液稀释一定倍数后混匀，充入计数池中，于显微镜下计数一定体积的血小板数，经换算求得每升血液内的血小板数。【实验试剂】：10g/L 草酸铵液 【实验器材】：显微镜、：改良 Neubauer 计数板【实验方法】：准备：取清洁干燥的小试管一支，加 10g/L 草酸铵液0.38ml准确取自然流出的外周血 20ul轻轻放入到上述稀释液底部回吸上清液漱洗吸管 23 次混匀室温静置 10 min清洁计数板、盖玻片混匀细胞悬液后充池静置 10 min15min于高倍镜下计数中央大方格内四角和中央 5 个中方格内血小板总数计算报告 计算：血小板数/L5 个中方格内血小板总数10 9/L【注意事项】：1. 所用试剂、器材应 10g/L 草酸铵液稀释液中无尘埃、细菌等污染。2.毛细血管采血时，针刺深度应达 3mm。采血要快避免血液凝固. 若遇血小板成簇分布时，应重采标本计数.3.细胞悬液充入计数池中静置时，应注意保持湿度，避免水分蒸发。
