1、1,病毒性肝炎 (Viral Hepatitis),西安交通大学第一附属医院 刘 正 稳,2,病毒性肝炎（viral hepatitis）是由多种肝炎病毒引起的、以肝脏病变为主的全身性传染病。目前已发现的肝炎病毒有5种，HAV、HBV、HCV、HDV、HEV。 HFV、HGV和TTV与肝炎的关系尚存争议；其他病毒如EB病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、风疹病毒等虽也能引起肝炎，但各有其临床特点，均不包括在本课程所讨论范围之内。,定义,3,公元前 “ 流行性黄疸”十九世纪末“卡他性黄疸”、“ 包特金氏病”1942年Voegt“ 病毒性肝炎” （传染性；血清性）1965年Blumberg“ 澳大利亚
2、抗原”、“HBV表面抗原”1970年DaneDane氏颗粒1973年FeinstoneHAV颗粒从此建立了甲型肝炎和乙型肝炎的命名。,简史（1）,4,1974年Prince - 经输血传播的“非甲非乙型肝炎”1977年Rizzetto -抗原、丁型肝炎病毒1980年Wong - 经肠道传播的“非甲非乙型肝炎”1987年日内瓦 - NANB（P）、NANB（E）1989年Choo - 丙型肝炎病毒1989年Reyes - 戊型肝炎病毒1996年Linner-庚型肝炎病毒1997年Nishizawa -输血相关性病毒（TTV）2000年Primi-SEN病毒(SENV),简史（2）,5,【病原学】
3、,6,甲型肝炎HAV,一、归属：属微小RNA病毒科一种新的病毒属嗜肝RNA病毒属。二、 形态：球形颗粒，直径2732nm，有核衣壳，基因组HAVRNA。没有外膜。HAV只有一种血清型，没有亚型。 三、基因组：7.5kb的单股、直线、正链RAN。,7,HAVRNA7.5kb,5,3,编码区,0.73kb,7.4kb,P1,P2,P3,1A 1B 1C 1D,2A 2B 2C,3A 3B 3C 3D,VPg,多聚病毒蛋白前体,3Dpol,3Cpro,8,5端的双尿嘧啶(UU)部位是与基因组联接蛋白(genone-linked protein, VPg）共价结合的部位。 5NTR中有两个嘧啶(U和C
4、)密集区 。（顺式调控序列）在肠道病毒的基因组RNA中5NTR的前约159个核苷酸由茎环结构形成“三叶草”形结构。135734nt是HAVRNA的内部核糖体进入部位。,9,1、 5端非编码区（5-UTR）：顺式调控序列、IRES、VPg 2、 P1区：编码4种蛋白（1A、1B、1C和1D） 构成病毒的核衣壳。 含有病毒抗原决定蔟（主要位于1C和1D）。 3、 P2区：编码3种蛋白（2A、2B和2C）。 2A是蛋白酶降解HAV复制过程中的中间体（负链RNA）。 2B的功能不清。 2C为调控蛋白调节HAVRNA的复制。是毒力所在基因区。,10,4、 P3区：编码4种蛋白（3A、3B、3C和3D）
5、3A是3B的前体形式。 3B是VPg（糖蛋白）是RNA复制时的引物， 3C是蛋白酶。 3D是RNA聚合酶，具有RNA指导的RNA合 成作用。 5、 3端非编码区（3-UTR）：有顺式调控序列，与HAV-RNA的稳定性有关,11,四、病毒变异和分型：对P1和P2（保守区和变异区，VP1和2A）交接点基因区进行核酸序列分析，以比较其同源性。根据其同源性的不同，HAV分为7个基因型。、和型为人源HAV株，型为人源或猴源HAV株，而、和则为猴源HAV株。 五、抵抗力：因为HAV不含脂蛋白外膜，所有可耐受有机溶剂（酸、碱、乙醚），对热有一定的耐受性，60一小时不能灭活HAV，98 1分钟可将其灭活。对低
6、温有一定的耐受力，但不耐受冷冻干燥。对紫外线敏感。,12,乙型肝炎病毒HBV,13,（一）、形态和结构： 1、形态：Dane颗粒、小球状颗粒、管状颗粒 2、结构：外膜、核衣壳、核心成分,一、 病毒性状,14,15,16,主蛋白,中蛋白,大蛋白,病毒外膜,核衣壳,HBV-DNA,DNAp,17,（二） 归属：嗜肝DNA病毒科（ Hepadnaviridae ）（1991年） 人乙型肝炎病毒（HBV）、土拨鼠肝炎病毒（WHV） 地松鼠肝炎病毒（DWHV）、鸭乙型肝炎病毒（DHBV） 1、病毒的大小、形态和结构相类似。 2、独特的复制方式。 3、组织泛嗜性。 4、其感染谱有很强的慢性化倾向，并与肝细
7、胞肝癌的 发生有密切的关系。 5、有比较严格的种属特异性。,18,3200bp，不完全等长的双链DNA分子，不完全闭合的环状结构。负链（长链）和正链（短链）粘性末端（224bp，）直接重复序列（DR1、DR2）：开放读架( open reading frame, ORF ),二、病毒基因组,负链,正链,DR2,DR1,19,20,C 区,3213,0/3220,635,1030,2223,484,3079,2771,X 区,S 区,P 区,HBV-DNA负链ORF示意图,21,Pr-S1,Pr-S2,S,sp1,sp2,2.4kb S-mRNA,转录表达,翻译合成,大蛋白,转录表达,2.1kb
8、 S-mRNA,中蛋白、主蛋白,S区结构、转录表达示意图,22,P 区,前C区,C 区,末端蛋白区,间隔区,DNAp区,RNA酶H区,cp,3.5kb C-mRNA（前基因组）,翻译合成,反转录,HBcAgP基因产物HBeAg,HBV-DNA负链,末端蛋白DNApRNA酶H,C区、P区结构、转录表达示意图,转录表达,DR1,23,X 区,Enh1,xp,DR2,Enh2,cp,DR1,0.8kb X-mRNA,X蛋白,转录表达,翻译合成,X区结构、转录表达示意图,24,三、病毒蛋白及功能,（一）外膜蛋白,N,S 抗原决定簇, 亚型共同抗原决定簇,COOH,1、主蛋白：、由226aa组成，占病毒
9、外膜蛋白的70。、S抗原决定簇。、亚型共同抗原决定簇 、亚型决定簇,亚型决定簇,25,124 137 139 147,122,160,HBsAg S抗原决定簇示意图,赖氨酸AAA（d）精氨酸AGA （y）,赖氨酸AAA （w）精氨酸 AGA（r）,nt 365,nt 479,亚型共同抗原决定簇,亚型抗原决定簇,亚型抗原决定簇,26,HBV亚型,27,2、中蛋白（1）、结构特点：pre-S2（55aa）、10、全序列表达、 N端连接着一个三支链的杂交型 N-聚糖 。（2）、pre-S2早期即可检出，其抗原性强，早期抗-preS2即可出现，如在发病后5个月内不能检出抗-preS2，提示有慢性化的可
10、能或是慢性乙肝的急性发作。（3）、与HBV附着肝细胞可能有关。 、pHSA 、N-聚糖 、 pre-S2的S端,28,3、大蛋白 （1）、由HBsAg和 Pre-S2和+ Pre-S1共同组成，其中Pre-S1由128aa所组成，占病毒外膜蛋白的20。是成熟病毒颗粒的标志。 （2）、在HBV附着肝细胞的过程中，Pre-S1起主要作用。Pre-S1有一氨基酸序列AA2147可以与肝细胞、B细胞表面的特异性受体结合，使HBV附着于细胞表面。 （3）、活化CD4Th，促进针对S和前S2的免疫应答。 （4）、具有损伤肝细胞的作用 。,29,（二）核衣壳蛋白1、HBcAg：、属于结构性的核壳蛋白，有保守
11、的三维结构。、是细胞免疫应答的主要靶抗原，CTL针对肝细胞表面所表达的HBcAg的细胞免疫应答，这种应答是引起肝细胞损伤的主要机制。 、HBcAg的AA107118和AA7782的区段可能有非连续性的B细胞表位，抗原性强，可刺激B细胞产生抗-HBc。、对HBcAg的免疫应答在HBV的清除中可能有重要作用。,30,2、HBeAg： （1）、属分泌型核壳蛋白。HBeAg在分泌出肝细胞前，存在一种前体蛋白（前C/C蛋白P25），是由前C区合成的，由212个氨基酸所组成。在信号肽酶和细胞蛋白酶的作用下，形成P1518的HBeAg分泌出肝细胞。可存在于外周血中。 （2）、HBeAg是由前C区编码，故它的
12、出现标志着HBV复制、传染性强。 （3）、分泌HBeAg也是诱导HBV免疫耐受的方式之一。,31,CD8CTL,肝细胞,E,C,HBeAg与免疫耐受,32,（三）X蛋白： X蛋白（Px）也称HBxAg是由XORF所编码，由154aa所组成。1、Px抗原性弱、只能在HBV感染的某一阶段检出，在临床上通常检测其抗体抗-HBx，代表病毒复制活跃。 2、转式激活作用： 所谓转式激活作用是指某一基因产物转而激活同一基因的远离部位，或另一基因的转录和表达。 （1）、激活HBV-DNA上的调节序列，增强HBV的复制。 （2）、上调MHC，增强类和类抗原的表达，介导CTL。 （3）、与肿瘤的发生有关，特别是肝
13、细胞癌。 激活人肿瘤基因，促进肿瘤发生。 与DNA修补蛋白作用，DNA变异积累。,33,（四）P基因产物 是由 816个氨基酸的多蛋白DNA多聚酶。末端蛋白、DNAp、RNA酶H。1、整体的DNA多聚酶可促进前基因组RNA的包装。2、末端蛋白是反转录DNA的引物。3、 DNAp具有反转录功能 。4、RNA酶H在反转录过程中降解前基因组RNA。,34,四、HBV细胞感染过程,（一）侵入（二）cccDNA形成（三）基因组转录（四）翻译合成蛋白（五）反转录HBV- DNA负链（六）转录正链（七）装配（八）分泌（十）整合,cccDNA,rcDNA,m-RNA,转录,侵入,HBV,病毒蛋白,翻译,反转录
14、负链,包装,C蛋白,转录正链,装配,S 蛋白,分泌,35,五、变异,（一）、HBV变异的原因：（二）、HBV变异的意义：（三）、热点变异及意义：,36,1、前C区突变：,前C区A83点突变也称终28变异，是HBV最常见的变异。发生率约3057；前C区nt83（nt1896）的GA，使AA28由色氨酸（TGG）变异为终止密码（TAG）。前C区A83易发生变异的原因可能与前C nt8386 有连续四个“G”有关，这样的结构稳定性差，易发生变异。,37,A A G,T P,DNAp,RNA酶H,nt 1930,A,nt 1896,前C/A83变异,TGG色氨酸,TAG终止码,G T T G C C
15、GC AT AT CG CG T G CG CG GC AT T T C AT G T C A T T G CG CG T G GC TA AT CG T G TA GC TA AT C T T G 5GCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATC ACCCGTATAAAGAATTTGGA3,nt 1858,38,前C区A83点突变的意义,（1）HBeAg合成障碍：（2）A83变异在HBV感染早期即可出现，随年龄、病期以及HBe的血清转换，A83变异株逐渐增加，甚至可形成HBeAg（）变异优势毒株，在HBV感染人群中流行。（3）HBeAg（）变异株HBV复制活跃： 变异
16、后前基因组干襻结构稳定有利于HBV的复制。 消除了前C基因的表达产物对HBV复制的抑制作用。（4）HBeAg（）变异株与HBV持续感染及肝脏炎症活动的关系： 是HBV逃避免疫的方式之一，与HBV感染慢性化有关。 前C区变异株与HBV感染重型化有关。（5）前C/A83变异是基因型依赖：A和F的1858位是C，很少变异。,39,2、C区变异,C区相对保守，但在HBV慢性感染中，C区变异并不少见。C区变异多发生在前C区A83变异之后。这可能是因前C变异后，C蛋白所承受的免疫压力增强所致。C区的变异多集中在C区中1/3处，表现为聚集变异，以多点突变和中段缺失多见。 多点突变多集中在多个短小的核苷酸序列
17、上，AA97的异亮氨酸被亮氨酸（L97）所替代，所以也称L97变异。 C区变异的结果可导致C蛋白的T、B细胞表位发生变化，使HLA抗原对C蛋白T细胞表位的结合表达障碍或CTL对C蛋白T细胞表位的识别障碍，最终导致CTL对HBV感染靶细胞的清除作用减弱，HBV感染得以持续。,40,3、X区变异,（1）早期的研究发现X基因区3端有8bp的缺失变异，结果造成X蛋白出现截短，影响X蛋白的反式激活作用，从而以此解释临床上所出现HBV血清标志物阴性，而HBV-DNA阳性的病例。（2） C基因启动子（cp）变异。cp的变异主要集中在Bcp上，表现为多点变异，Bcp的双点变异nt1762的AT和nt1764的
18、GA，在慢性HBV感染中较常见。Bcp变异株的生物学特性主要表现为HBeAg合成水平下降，但HBV复制水平反而升高。,41,4、S区变异,S区变异的研究热点主要集中在决定簇的变异，即AA145变异（AA145位的甘氨酸被精氨酸所替代）。其变异的结果是病毒抵制宿主中和免疫的主要方式。临床上HBsAg（）的HBV感染可能与S区变异有关。,42,核苷酸结合槽,HBV多聚酶模型,5、P区YMDD变异,43,Y,M,D,D,Y = 酪氨酸M = 蛋氨酸D = 天冬氨酸V = 缬氨酸I = 异亮氨酸,HBV -DNAp（野生株）,拉米夫定和野生株,核苷酸,3TC,HBV DNA（）,反转录复制,V,I,5
19、50,CmRNA,44,丙型肝炎病毒HCV,45,NANB肝炎黑猩猩血浆（1L） 稀释后超速离心 提取沉降物中的DNA和RNA 变性处理 单链DNA和RNA 用随机引物逆转录 DNA或cDNA 克隆 噬菌体载体 括增、高效表达 多肽抗原 NANB患者血清 硝酸纤维滤膜 放射性自显影 特异性抗原（5-1-1） 纯化阳性克隆、基因序列分析 丙肝病毒基因序列 NANB肝炎病毒基因发现过程,46,一、HCV基因结构,ORF（9033nt）,结构基因,功能基因,5UTR,3UTR,C,E1,E2/NS1,NS2,NS3,NS4,NS5,9.4kb,翻译,多聚蛋白前体（3010aa）,裂解,C,HVR1,
20、HVR2,NS2（a+b）,NS3,NS4（a+b）,NS5（a+b）,47,二、HCV病毒蛋白,（一）结构蛋白,1、核心蛋白： 具有T细胞的表位： T细胞表位在肝细胞膜上的表达： T细胞表位与CTL细胞： 具有B细胞的表位： 基因调控作用： 抑制HBV表达： 对肝细胞原癌基因的调节：P53, c-myc,48,肝细胞,CTL,MHC-I,C蛋白,TCR,CD3,CD8,49,2、包膜蛋白（1）E1蛋白具有与肝细胞的结合部位： （2）E2具有中和抗原表位，可刺激机体产生中和抗体。与病毒清除和疫苗制备有关。（3）变异性较大：E2/NS1区为高变区，变异是持续性的，与HCV逃避机体免疫监视使感染慢
21、性化有关。同时也给疫苗的研制带来很大的困难,50,（1）NS3： NS3区的前1/3有蛋白酶作用，对所有非结构蛋白的位点有切割作用。所以，NS3对于HCV非结构蛋白的产生是必须的，但NS3蛋白酶必须与Zn和NS4结合后才能发挥作用；NS3可裂解肝细胞肿瘤基因（如c-raf等）的产物，使其激活而诱发HCC。有人认为，抑制NS3的活性可能成为抗HCV治疗的方向。 NS3的后2/3有ATP酶和解旋酶的作用。NS3可通过解旋酶活性诱导肝细胞基因组的不稳定性，以至发生基因突变诱发肿瘤。 近期有研究表明NS3的C末端存在CD4T细胞的应答表位。认为含有该表位的T细胞免疫疫苗有望提高特异性免疫应答水平。 有
22、文献证实NS3含有一个序列，具有介导免疫细胞粘附的作用，其结果导致免疫细胞消耗，作者认为NS3的这一功能与HCV的免疫逃逸有关。,（二）功能蛋白,51,（2）NS5：主要表达RNA指导的RNA聚合酶，与HCV-RNA的复制有关。NS5有一短小序列的变异与干扰素的疗效有关，将该区域称“干扰素敏感决定区”。研究发现NS5序列的变异以点突变为主，主要变异集中在第AA2218附近的40 aa内。其变异的结果主要影响NS5编码蛋白的磷酸化程度，从而影响NS5的功能。干扰素敏感区可与RNA依赖的蛋白激酶（PKA）结合，影响其活性的发挥。PKA是抑癌因子，PKA的功能被抑制后，使宿主细胞蛋白合成无法停止，最
23、终导致永生性细胞形成。 NS5可编码一种IFN的抑制蛋白，其结果导致患者对IFN治疗的应答率降低。,52,现有的资料表明HCV属于黄病毒科丙型肝炎病毒属，在血液中完整的HCV病毒颗粒直径约55nm，有7nm厚的外膜，表面有7nm的凸起。除去外膜后可见3035nm大小的病毒核壳，呈正二十面体结构。 除完整的HCV颗粒外，还可见其他形式的HCV病毒颗粒，如与脂蛋白或免疫球蛋白结合的病毒颗粒、异常或不完整的裂解病毒、感染细胞释放的HCV颗粒小泡等。 据文献报道HCV颗粒密度的高低与病情和治疗有一定的关系，低密度颗粒主要见于急性HCV感染，且对干扰素的应答良好；而高密度颗粒主要见于慢性HCV感染，且对
24、干扰素治疗的应答不良。,三、HCV形态：,53,四、HCV的分型研究：,目前对HCV的分型尚无统一的标准，有按作者命名的分类法、基因分型法、血清学分型法、遗传树分型法以及DNA-酶免疫法等分类的方法。目前应用基因分型较多，可根据不同序列核苷酸的同源性将HCV分为若干基因型。一般多按NS5区核苷酸同源性的差异分型，将同源性72视为新的HCV基因型，而同源性在7586视为新的亚型，目前将HCV分为IVI型，及9个亚型。,54,丁型肝炎病毒HDV,55,HDV是一种缺陷型RNA病毒，也有人称之为嵌合性（chimeric）嗜肝RNA病毒。是嗜肝DNA病毒的卫星亚病毒。其归属目前仍无定论，有资料显示HD
25、V具有植物类病毒（viroid）和卫星RNA病毒的一些特点，与类病毒有很高的同源性，认为是由卫星RNA进化而来。,一、归属：,56,二、形态：,36nm,HBV外膜蛋白,S 前S1 前S2,HDAg,HDV-RNA,57,三、HDV基因组,795,795,1638,1638,HDV基因组,HDV抗基因组,L-HDAg,S-HDAg,0.8kb mRNA,核酶序列,（一）基因组：负链RNA，闭合环状，棒状结构。1685nt。（二）抗基因组： 1、存在于肝细胞内。 2、是HDV复制的中间体。 3、有510个ORF。编码2个HDAg。（三）核酶：85nt（四）基因型： I 型：世界各地，同源性80%
26、以上。致病性强。 II 型：东南亚，致病性弱。 III 型：南美，与暴肝有关。,58,四、病毒复制,G,AG,G,AG,59,五、病毒蛋白,HDV的核壳蛋白有大小两种，一个是由214个氨基酸组成的大HDAg，一个是由195个氨基酸组成的小HDAg。对HDAg的了解甚少，有资料显示：小HDAg对HDV的复制有转式激活作用，大HDAg对HDV复制有转式抑制作用。大HDAg的C端具有装配信号，参与病毒的装配。HDAg有独特的功能是将HDV-RNA蓄留在肝细胞核内，病毒在此活跃复制。HDAg的抗原性较弱，抗HD似非中和抗体。大HDAg有几个B细胞表位，其优势表位在AA5293，T细胞表位尚无所知。,6
27、0,戊型肝炎病毒HEV,61,戊型肝炎过去也称肠道传播的非甲非乙型肝炎。世界上首次记载本病的流行是于19551956年发生在印度新得里，共计发病97000例，其中29300例为黄疸型肝炎。1980年Wong用血清学排除法证实此次流行属肠道传播的非甲非乙型肝炎。 1983年Balayan等用免疫电镜技术从粪便中检出2738nm病毒颗粒。1989年Reyes获得病毒基因序列，同年东京国际肝炎会议正式将肠道传播的非甲非乙肝炎命名为戊型肝炎。,62,一、病毒颗粒,HEV属于杯状病毒科（萼状病毒科），是RNA病毒的第三亚组。病毒颗粒呈球形，无包膜，大小为27 34nm，表面有锯齿状突起。病毒颗粒有二种形
28、态，一种是内部完整的致密颗粒；另一种是有缺陷的内部透亮的不完整颗粒。,63,二、基因组及表达产物：,HEV基因组为单股正链RNA，全长7.5kb，分为结构区和非结构区。有三个部分重叠的ORF，ORF1编码非结构蛋白，ORF2编码核壳蛋白，可能是中和抗体的表位。ORF3位于ORF-1和ORF-2之间，与ORF-1部分重叠，与ORF-2广泛重叠，可能编码部分核壳蛋白，其表达产物含有病毒特异性免疫应答的抗原决定簇。,64,65,庚型肝炎病毒HGV,66,输血传播病毒 TTV,67,【流行病学】,68,一、 传染源： （一）、患者：1、 甲肝和戊肝：传染性主要在潜伏期末和急性期。2、 乙肝、丙肝、丁肝
29、：慢性患者为主要传染源。 （二）、病毒携带者：暂时携带和慢性携带1、 暂时携带：包括急性肝炎患者和隐性感染者2、 慢性携带：、 乙（10）、丙（3）、丁型肝炎（1.6）、 无症状HBsAg携带者（AsC）：是HBV感染的最主要的传染源。、 甲型和戊型肝炎不存在慢性携带,69,二、 传播途径： （一）、甲型肝炎和戊型肝炎：主要是经消化道 （二）、乙型肝炎、丙型肝炎等：1、 血液、医源性传播：、 血液：、 药瘾者感染：，HBV50、HCV35。、 医源性传播：、 吸血昆虫：蚊子、臭虫。,70,2、母婴传播：、垂直传播（包括种系传播和宫内传播）：、围生期传播：围生期传播是婴儿HBV感染的最重要方式。
30、、水平传播：超过垂直传播2倍。、关于母乳喂养HBV感染的问题：3、 日常生活（社区传播）：4、性接触传播：,71,乙型肝炎传播途径,72,三、 易感性：1、 甲型肝炎：免疫力牢固，可维持终身。2、乙型肝炎：中和抗体在成年人体内滴度较低，新生儿缺乏先天性的被动免疫；故出生后对HBV普遍易感。随年龄的增长，因隐性感染而获免疫的人群增加，在我国30岁以上的成年人近50抗-HBs阳转。故HBV新近感染多发生于婴幼儿和青少年。成年人中的HBV感染多属于HBV的慢性感染。3 丙型肝炎：凡未感染过HCV者，不分年龄和性别对HCV普遍易感。4、 丁型肝炎：HDV的感染只发生在HBV感染者，且抗-HDIgG并非
31、保护性抗体。5、 戊型肝炎：凡未感染HEV者对HEV普遍易感，各年龄组均可发病。小儿感染HEV后多表现为隐性感染，而成年人感染HEV后多表现为显性感染。感染后其免疫力维持时间较短，一年后其抗体基本消失，故丙种球蛋白预防戊型肝炎无效。,73,四、 流行特征： 1、地区性： 2、流行性： 3、季节性：,74,HBV慢性携带者（3.5亿慢性携带者）（分布）百分率, 8% 高度分布区,HBV慢性携带者的地区分布情况,Margolis et al. 1991,75,慢性乙肝感染的自然史,死亡,100,30,9,76,【肝组织损伤机制】,77,乙型肝炎肝细胞损伤机制示意图,78,APC,CTL,HC,Th1,B,M,CD4,TCR,IFN ,IL-4, IL-10,IL-2,MHC-,MHC-,CD8,IL-12,TNF,TCR,Th0,Th2,IFN ,IL-4,IL-2,IL-4,ADCC,C,内毒素,HBV,乙肝细胞免疫基础,79,【病理解剖】,80,一、 基本病理改变,（一） 肝细胞变性：1、 气球样变：2、 嗜酸性变：（二） 炎症坏死1、 点状和灶状坏死：2、 碎屑状坏死：3、 桥状坏死：4、 融合性坏死：（三） 汇管区和血窦炎性反应：（四） 纤维组织增生及肝细胞再生：,
