1、生物化学与分子生物学,DNA损伤与修复 DNA Damage and Repair,第十五章,各种体内外因素所导致的DNA组成与结构的变化称为DNA损伤（DNA damage）,其一，DNA的结构发生永久性改变，即突变 其二，导致DNA失去作为复制和/或转录的模板的功能,DNA损伤的后果:,生物多样性依赖于：,DNA突变,DNA修复,平衡,DNA损伤DNA Damage,第一节,一、多种因素通过不同机制导致DNA损伤,（一）体内因素,DNA复制错误 DNA自身的不稳定性 机体代谢过程中产生的活性氧,DNA复制错误：,在DNA复制过程中，碱基的异构互变、4种dNTP之间浓度的不平衡等均可能引起碱
2、基的错配DNA复制的错配率约1/1010复制错误还表现为片段的缺失或插入。特别是DNA上的短片段重复序列，在真核细胞染色体上广泛分布，导致DNA复制系统工作时可能出现“打滑”现象，使得新生成的DNA上的重复序列拷贝数发生变化。,亨廷顿病性痴呆由Huntington于1872年首先报道，故而得名。属单基因常染色体显性遗传疾病。其脑变性部位广泛，尤以尾状核的萎缩明显，系一种罕见的特发性神经变性疾病。临床主要表现为痴呆和舞蹈样动作。本病较为少见。估计为4/10万10/10万人。年轻发病者症状一般较重，以肌强直为主，中年发病者以舞蹈症状为主，60岁以上发病者以意向性震颤为主。少年型患者少见。,脆性X综
3、合征,2 0世纪初一些学者注意到智力低下患者中男性多于女性。1943年Martin和Bell在一个家系两代人中发现11名男性患者和两名轻度智力低下的女性，认为该家系智力低下是与X连锁的，因此X连锁智力低下又称为Martin-Bell综合征。1969年Lubs首先在男性智力低下患者及其女性亲属中发现了长臂具有“随体和呈细丝状次缢痕”的X染色体。后来，Sortherland 证明细丝位位于X染色体长臂2区7带（Xq27）。它在低叶酸培养条件下表达，并提出了脆性部位（fragile site）的概念。现今人们把在Xq27处有脆性部位的X染色体称为脆性X染色体（fragile X,fra X），而它所
4、导致的疾病称为脆性X染色体综合征。,临床表现,主要表现为中度到重度的智力低下，其它常见的特征尚有身长和体重超过正常儿，发育快，前额突出，面中部发育不全，下颌大而前突，大耳，高腭弓，唇厚，下唇突出，另一个重要的表现是大睾丸症。一些患者还有多动症，攻击性行为或孤癖症，中、重度智力低下，语言行为障碍。20%患者有癫痫发作。,主要表现为中度到重度的智力低下，其它常见的特征尚有身长和体重超过正常儿，发育快，前额突出，面中部发育不全，下颌大而前突，大耳，高颚弓，唇厚，下唇突出，另一个重要的表现是大睾丸症。一些患者还有多动症，攻击性行为或孤癖症，中、重度智力低下，语言行为障碍。20%患者有癫痫发作。,发病机
5、理,致病基因是FMR-1，它含有（CGG）n 三核甘酸重复序列，后者在正常人约为45个拷贝以内，而在正常男性传递者和女性携带者增多到50-200个拷贝，称为小插入，相邻的Cpg 岛未被甲基化，这种前突变（premutation ）无或只有轻微症状。女性携带者的CGG区不稳定，在向受累后代传递过程中扩增，以致在男性患者和脆性部位高表达的女性达到200个拷贝以上，相邻的CpG岛也被甲基化。这种全突变（full mutation）可关闭相邻基因的表达，从而出现临床症状。由前突变转化为完全突变只发生母亲向后代传递过程中。,DNA自身的不稳定性 ：,DNA结构自身的不稳定性是DNA自发性损伤中最频繁和最
6、重要的因素。当DNA受热或所处环境的pH值发生改变时， DNA分子上连接碱基和核糖之间的糖苷键可自发发生水解，导致碱基的丢失或脱落，其中以脱嘌呤最为普遍。含有氨基的碱基还可能自发脱氨基反应，转变为另一种碱基，即碱基的转变，如C转变为U，A转变为I（次黄嘌呤）等。,（二）体外因素,物理因素化学因素生物因素,物理因素：电离辐射、紫外线(ultra violet, UV),化学因素：,自由基导致的DNA损伤碱基类似物导致的DNA损伤 碱基修饰剂、烷化剂导致的DNA损伤 嵌入性染料导致的DNA损伤,物理和化学因素对DNA的损伤,二、DNA损伤有多种类型,碱基脱落碱基结构破坏嘧啶二聚体形成DNA单链或双
7、链断裂DNA交联,碱基损伤与糖基破坏：,化学毒物可通过对碱基的某些基团进行修饰而改变碱基的性质。由于碱基损伤或糖基破坏，在DNA链上可能形成一些不稳定点，最终可导致DNA链的断裂。,碱基之间发生错配 ：,碱基类似物的掺入、碱基修饰剂的作用可改变碱基的性质，导致DNA序列中的错误配对。在正常的DNA复制过程中，存在着一定比例的自发碱基错配。最常见的是组成RNA的尿嘧啶替代胸腺嘧啶掺入到DNA分子中。,DNA链发生断裂：,电离辐射、化学毒剂、磷酸二酯键的断裂、脱氧戊糖的破坏、碱基的损伤和脱落都是引起DNA断裂的原因。碱基损伤或糖基破坏可引起DNA双螺旋局部变性，形成酶敏感性位点，特异的核酸内切酶能
8、识别并切割这样的部位，造成链断裂。DNA链上被损伤的碱基也可以被另一种特异的DNA-糖基化酶除去，形成无嘌呤嘧啶位点（apurinic-apyrimidinic site, AP site），或称无碱基位点（abasic site），这些位点在内切酶等的作用下可形成链断裂。,DNA 的共价交联：,DNA双螺旋链中的一条链上的碱基与另一条链上的碱基以共价键结合，称为DNA链间交联（DNA interstrand cross-linking）。DNA分子中同一条链中的两个碱基以共价键结合，称为DNA链内交联（DNA intrastrand cross-linking）。DNA分子还可与蛋白质以共价
9、键结合，称为DNA-蛋白质交联（DNA protein cross-linking）。,DNA损伤可导致,碱基置换缺失 插入 链的断裂,DNA损伤的修复The repair of DNA damage,第二节,DNA修复（DNA repair）是指纠正DNA两条单链间错配的碱基、清除DNA链上受损的碱基或糖基、恢复DNA的正常结构的过程。DNA修复是机体维持DNA结构的完整性与稳定性，保证生命延续和物种稳定的重要环节。,常见的DNA损伤修复途径,一、有些DNA损伤可以直接修复,嘧啶二聚体的直接修复 烷基化碱基的直接修复 无嘌呤位点的直接修复 单链断裂的直接修复,嘧啶二聚体的直接修复,烷基化碱基
10、的直接修复,无嘌呤位点的直接修复,DNA嘌呤插入酶能催化游离嘌呤碱基或脱氧核苷与DNA嘌呤缺失部位重新生成糖苷共价键，导致嘌呤碱基的直接插入。具有很强的专一性。,单链断裂的直接修复,DNA连接酶能够催化DNA双螺旋结构中一条链上缺口处的5-磷酸基团与相邻片段的3-羟基之间形成磷酸二酯键，从而直接参与部分DNA单链断裂的修复，如电离辐射所造成的切口。,二、切除修复是最普遍的DNA损伤修复方式,碱基切除修复 核苷酸切除修复,碱基切除修复（base excision repair）, 识别水解：DNA糖基化酶特异性识别DNA链中已受损的碱基并将其水解去除，产生一个无碱基位点； 切除：在此位点的5端，
11、无碱基位点核酸内切酶将DNA链的磷酸二酯键切开，去除剩余的磷酸核糖部分； 合成：DNA聚合酶在缺口处以另一条链为模板修补合成互补序列； 连接：由DNA连接酶将切口重新连接，使DNA恢复正常结构,核苷酸切除修复（nucleotide excision repair）, 首先，由一个酶系统识别DNA损伤部位； 其次，在损伤两侧切开DNA链，去除两个切口之间的一段受损的寡核苷酸； 再次，在DNA聚合酶作用下，以另一条链为模板，合成一段新的DNA，填补缺损区； 最后由连接酶连接，完成损伤修复。,E.coli的NER主要由4种蛋白质组成：UvrAUvrBUvrCUvrD,人类的DNA损伤核苷酸切除修复,
12、 首先由损伤部位识别蛋白XPC和XPA等，再加上DNA复制所需的SSB，结合在损伤DNA的部位； XPB、XPD发挥解旋酶的活性，与上述物质共同作用在受损DNA周围形成一个凸起； XPG与XPF发生构象改变，分别在凸起的3-端和5-端发挥核酸内切酶活性, 在增殖细胞核抗原（PCNA）的帮助下，切除并释放受损的寡核苷酸； 遗留的缺损区由聚合酶或进行修补合成； 最后，由连接酶完成连接。,NER不仅能够修复整个基因组中的损伤，而且能拯救因转录模板链损伤而暂停转录的RNA聚合酶，即参与转录偶联修复（transcription-coupled repair）。作用方式：NER蛋白质被募集于暂停的RNA聚
13、合酶。转录偶联修复的意义：将修复酶集中于正在转录DNA，使该区域的损伤尽快得以修复。,着色性干皮病是一种常染色体隐性遗传性皮肤病，发病率约1：25万，特征是UV照射后DNA损伤不能修复。患者对日光高度敏感，有畏光现象。光暴露部位皮肤萎缩、大量的雀斑样色素加深斑，继而出现新生物，可有多系统累及，许多患者可伴有眼球、神经系统等病变。,碱基错配修复（ mismatch repair）,错配是指非Watson-Crick碱基配对。碱基错配修复也可被看作是碱基切除修复的一种特殊形式，主要负责纠正： 复制与重组中出现的碱基配对错误； 因碱基损伤所致的碱基配对错误； 碱基插入； 碱基缺失。,E.coli错配
14、修复系统修复复制差错,Dam甲基化酶（methylase）使E.coli处于暂时的半甲基化状态，标记母链和新合成的DNA链，帮助新合成的DNA链被错配修复系统识别并修复。,模板链的GATC序列甲基化,MutH仅切割新合成的DNA链,MutH的切口位于错配核苷酸的5侧，使用外切酶或RecJ，按53方向降解DNA；切口位于错配的3侧，则使用外切酶，按3 5方向降解DNA。DNA聚合酶填补所产生单链DNA缺口。,MSH（MutS homologs）蛋白与MutL同源的MLH和PMS蛋白,真核细胞错配修复系统无MutH，也无半甲基化标记母链。错配修复系统利用冈崎片段连接前的DNA缺口辨别错配碱基所在的
15、DNA链。,真核细胞核苷酸修复错配系统：,三、DNA严重损伤时需要重组修复,同源重组修复 非同源末端连接的重组修复,同源重组修复,四、某些修复发生在跨越损伤DNA的复制事件之后,重组跨越损伤修复 合成跨越损伤修复,SOS修复中LexA-RecA操纵子的作用机制,DNA损伤和修复的意义The significance of DNA damage and repair,第三节,一、DNA损伤具有双重效应,一是给DNA带来永久性的改变即突变，可能改变基因的编码序列或者基因的调控序列；二是DNA的这些改变使得DNA不能用作复制和转录的模板，使细胞的功能出现障碍，重则死亡。,DNA损伤通常有两个生物学后果,二、DNA损伤修复障碍与肿瘤等多种疾病相关,DNA损伤与肿瘤、衰老以及免疫性疾病等多种疾病的发生有着密切的关联,
