1、东北师范大学,干细胞工程与治疗,东北师范大学,细胞核移植（续）,东北师范大学,东北师范大学,核移植受体细胞质的准备,受体胞质主要有三类；M期卵母细胞，合子期受精卵和2细胞期胚胎，以M期卵母细胞最为常用。因M期卵母细胞核、质均已发育成熟，含有足量的促使移植核再分化所必需的各种核重编程因子，不仅是最适合的体外受精配子，也是最适合的体细胞核移植受体。,东北师范大学,东北师范大学,减数分裂,M,东北师范大学,东北师范大学,M期卵母细胞,M期卵母细胞含高水平细胞促成熟因子(MPF)，能启动细胞周期由G2向M期转变，导致核膜消失、染色体集缩、纺锤体形成等，这些正是供体核发生、发育程序重编所必需的形态变化。
2、M期卵母细胞的第二极体易于观察，因为染色体位于第二极体附近，甚至有通道连接，便于染 色体定位于去核操作,东北师范大学,东北师范大学,普通注射针与压电针的比较,东北师范大学,卵母细胞的去核,吸核法：细胞置于含有细胞松弛素的培养液中，破坏细胞骨架，增加膜流动性，去核后细胞膜仍保持完整。用去核针穿过透明带，将染色体吸出。完全去核是核移植能否成功的关键，遗传物质残留会阻碍重组胚发育。,东北师范大学,东北师范大学,卵母细胞的去核-化学诱导去核,用秋水仙胺处理激活的M早期卵母细胞，促排第二极体，由于药物作用使M染色体不能分离，进而全部进入第二极体，达到去核目的。此法易于操作，可一次性处理大量卵母细胞。,东
3、北师范大学,东北师范大学,重组胚的构建-电融合法,先将供体细胞核注射到卵母细胞的卵周隙内，形成供体核卵母细胞复合体。在电场脉冲的作用下膜表面形成微孔进而融合。融合条件随溶液、设备及细胞不同而改变，需进行摸索。以将要引起细胞发生溶解的脉冲强度为最佳融合电参数。,东北师范大学,东北师范大学,重组胚的构建-核注射法,通过显微注射将细胞核直接注入卵母细胞质。注射前需用较小针头反复抽吸供体细胞核，使其充分去掉细胞质。适合细胞核较小，电融合比较困难的核移植。,东北师范大学,东北师范大学,重组胚的激活,由于缺少受精步骤，重组胚必须进行人工激活后才能进一步发育。瞬间性钙震荡是精子入卵后引起激活及胚胎发育的基础
4、。震荡频率、振幅及持续时间都将影响胚胎发育。凡能引起钙震荡的方法都能激活卵母细胞及核移植胚胎。,东北师范大学,东北师范大学,受精瞬间触发的卵细胞钙震荡(calcium wave),东北师范大学,东北师范大学,重组胚孤雌激活的常用方法,电激活:高压直流脉冲形成瞬间微孔，钙离子进入，卵母细胞激活，多次脉动可提高激活率。乙醇激活：8%乙醇处理细胞5分钟，启动膜IP3形成，介导钙库释放钙离子。锶离子激活：与钙同属二价阳离子，能够进入细胞内钙库，能够在一定时间内引起波动性钙离子释放，与正常受精过程中瞬时性钙震荡十分相似。,东北师范大学,东北师范大学,抑制重组胚第二极体排放,抑制第二极体排放M细胞具有向单
5、倍体卵细胞分裂的倾向，即便是核置换后也如此，必须阻止第二极体排放而再次形成卵子，使其发育成向囊胚。加入二甲氨基嘌呤(6-DMAP)可抑制抑制成熟促进因子（MPF）活性，阻止卵母细胞成熟分裂，维持二倍体状态，利于移植核的去分化及重编程。,东北师范大学,东北师范大学,供体细胞核与受体细胞质相互作用,G1期核早期移入后凝集成单个染色体丛，只形成一个原核，不形成极体。G1晚期核移入后易形成多个染色体丛，形成一个原核外，常排出多个极体，导致重组胚染色体异常。S期更是如此。供体细胞在移核前要用0.5%血清的培养基进行适度饥饿培养，迫使细胞停滞在G1期，有利于与受体细胞质的协调性。接触抑制的细胞也常为G1期
6、。,东北师范大学,东北师范大学,供体细胞类型与供体细胞周期相,分化程度低越有利于程序重编，发育潜能也越高。成体细胞中，卵丘细胞更适于做核移植的供体。G0/G1期对重组胚发育有利。G2期由于DNA已经合成，需再复制一次才能分裂，因而易产生多倍体子细胞。,东北师范大学,东北师范大学,供体细胞核与受体细胞质相互作用,核移植后,延长核质相互作用时间可促进核重塑及发育程序的重编程。G0与G1早期细胞此时DNA合成未开始，细胞活动缓慢，移入卵母细胞后需用较长时间从抑制状态恢复，这恰好利于卵母细胞质对移植核的再编程过程。,东北师范大学,干细胞治疗,东北师范大学,干细胞治疗的特点,仅需一次或几次介入治疗，影响
7、长远； 不需要完全了解疾病发生的确切机理；是最好的免疫治疗和基因治疗载体；成体干细胞不会诱发畸胎瘤的发生；自身干细胞移植无组织相容性的问题，可避免长期应用免疫抑制剂；不存在伦理学争议。,东北师范大学,干细胞治疗机理,替代修复死亡和受损的细胞组织。激活休眠和处于抑制状态的细胞。发挥旁分泌作用，释放细胞因子，包括营养、生长及抗凋亡因子等。促进细胞间传导能力，包括电刺激、电传导、细胞连接、传导通路重建、离子通道开放与介质释放等。,东北师范大学,干细胞移植的安全性问题,除结果观察外，移植后一般不易证实在靶器官中能否产生足够的效应细胞。异源污染：是否能避免动物性污染。致癌性：干细胞体外培养扩增能否形成突
8、变积累，干细胞有形成畸胎瘤的倾向。移植稳定性：移植后的免疫排斥问题。,东北师范大学,不同组织细胞iPS的致瘤性差异,山中伸弥等人用iPS方法将不同小鼠细胞诱导成神经细胞，植入小鼠脑部，观察致畸胎瘤的能力。致瘤性最低:胃细胞来源的iPS（0%）。致瘤性较低：胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞来源的iPS（8%）。致瘤性最高：鼠尾皮肤细胞iPS（83%）,东北师范大学,iPS神经细胞的致癌性,Rochester大学Steven Goldman将人ES用iPS法诱导成神经细胞，移植到灭活多巴胺分泌神经元大鼠的脑部，八周内动物的运动功能都得以恢复。然而，在移植10周后发现，只有1/5的移植细胞产生多巴胺，其余
9、正朝无法控制的脑瘤转化。,东北师范大学,造血干细胞移植,历史悠久，最成熟的移植技术；外周血造血干细胞移植恢复快，排异反应低于骨髓造血干细胞移植;脐带血特别是胎盘造血干细胞移植，尽管成本较高但配型宽松，排异反应低，不需术后用药等优点，有望取代其它方式的移植。目前只有少数发达国家建有大型脐带血库。,Edward D Thomas,东北师范大学,造血干细胞生物学特性,高度自我更新及分化潜能；非增殖状态，95%以上处于G0期；缺乏系相关抗原；不对称分裂方式；高度表达CD34和CDW90。,骨髓；1/400脐带血；1/10000外周血；1/100000,东北师范大学,造血干细胞的分离,免疫吸附法（抗原和
10、抗体特异性结合）,磁性标记CD34单克隆抗体,加入供体外周血,抗原和抗体特异性结合,通过分选系统,造血干细胞吸附到柱子上,其它细胞留在血液中,东北师范大学,人类白细胞抗原（HLA）配型,一类抗原：HLA-A，HLA-B，HLA-C二类抗原：HLA-D（DR、DQ、DP）三类抗原：C4A，C4B，C2，Bf前两类与移植排斥反应主要相关，其中对HLA-A、HLA-B和HLA-DR的等位基因检测尤为重要。匹配度高成功率高。配型来源：亲属、父母、同胞、同卵双生。干细胞库(脐血、骨髓和外周血干细胞库）可以很好解决排斥问题。,东北师范大学,造血干细胞移植治疗地中海贫血,患者：16列度重型B地贫患儿。供者：
11、患者父或母，提供HLA单倍体相合外周血造血干细胞。患者预处理：氟达拉滨+白消安+环磷酰胺+抗胸腺细胞抗体+全身照射；患者移植物抗宿主病(GVHD)预防:环孢素+甲氨蝶呤+霉酚酸酯供者预处理：G-CSF等，动员造血干细胞。4天后分离造血干细胞，立即输给患者。5天和3个月后各重复一次。,东北师范大学,移植过程及移植后治疗,干细胞输注：输注后次日给G-CSF， 至白细胞恢复正常后停用。感染预防：预处理前一周入住净化无菌病房；乙肝携带者药物预防病毒复制；给予预防真菌与细菌感染、肺孢子虫感染药物，同时监测血象和体征。支持治疗：反应过重无法进食时输营养液；血红蛋白过低时输红细胞；血小板过低时输血小板。,东
12、北师范大学,移植后治疗及结果检测,肝静脉栓塞VOD的治疗：给予去纤苷移植物抗宿主病的治疗：给予免疫抑制剂，严重者激素治疗、CD25单抗(舒莱)，其它症状则对症治疗。植活及嵌合状态检测：分别在植入30天和90天进行荧光原位杂交(FISH)测定骨髓造血细胞中的性染色体的细胞比例，或检测短串联重复序列(STR)。,东北师范大学,造血干细胞移植治疗结果,造血功能重建情况：16例中14例成功植入，造血迅速重建。2例患者未能植入，其中l例52天后恢复自体造血，另1例32天后死于重度GVHD。植活证据：30天后14例患者均为供者型完全嵌合状态，90天后13例仍处于完全嵌合状态，1例于第68天死于肠道重度GV
13、HD。 1例广泛型慢性GVHD，表现为全身硬皮病样变化，经药物治疗后症状缓慢减轻，37个月后仍存活。,东北师范大学,自体骨髓干细胞移植治疗肝硬化,50位患者：肝硬化体征，包括纳差、乏力、腹胀，腹水，生化指标符合。干细胞采集：穿刺抽取骨髓200ml，肝素抗凝，分离骨髓干细胞。干细胞移植：经股动脉穿刺插管至肝固有动脉，将干细胞悬液10ml于0.5 小时内经左右肝动脉缓慢注入。预防性给予抗菌药物连续3天。,东北师范大学,骨髓干细胞分离,东北师范大学,骨髓获取与肝部植入,东北师范大学,骨髓干细胞移植治疗结果,体征变化:移植后8周内腹水减轻41例，食欲改善例45例，腹胀减轻45例。血清生化指标变化：移植
14、后14天出现好转，28显著好转，56天总胆红素显著降低；胆固醇显著升高；凝血酶原时间显著缩短；白蛋白显著升高，不用补充。不良反应：所有患者未出现严重不良反应。2例患者3个月后死于肝硬化所致消化道大出血。,东北师范大学,胚胎干细胞治疗脑部疾病,霍普金斯大学研究小组将鼠胚胎干细胞由特定因子诱导后，植入“残疾鼠 ”脊髓内。干细胞在髓内定向成长为运动神经元，并在脊髓与腿部肌肉之间形成连接神经。经过6个月治疗，15只瘫痪的老鼠中有11只获得部分康复。目前干细胞移植治疗小儿脑瘫逐渐被人们所熟知。,东北师范大学,帕金森氏症parkinsons disease,中脑黑质多巴胺（dopamine, DA）能神经
15、元的变性死亡，由此而引起纹状体DA含量显著性减少而引起的运动障碍。,东北师范大学,干细胞移植治疗帕金森氏症,东北师范大学,脐带间充质干细胞治疗帕金森病,患者：50-78岁8例，级。干细胞制备及鉴定：脐带浸于含双抗的PBS中运回。冲洗脐带血管。将脐带剪碎，加入消化液(含胰酶与胶原酶的PBS)，37 中消化4 h，10 min振摇1次。将消化上清转移到培养瓶中，加入DMEM/F12培养基（15%优质胎牛血清)，每3 天半量换液扩增用流式仪检测表面标志：CD29、CD44、 CD90、CD105的阳性率应在95%以上，CD34、CD45表达阴性。,东北师范大学,脐带间充质干细胞治疗帕金森病,间充质干
16、细胞移植：入院2周后进行颈动脉穿刺移植治疗。在10 min内缓慢注入间充质干细胞注射液20 mL(4107)，每周1次或再次。辅助治疗：扩张血管、抗自由基、神经营养、稳定细胞膜等药物。评估标准：移植前和移植后1个月比对，采用该病统一评分标准评定。分为精神、行为和情绪、日常活动、运动功能、治疗的并发症。,东北师范大学,脐带间充质干细胞移植治疗结果,8例患者均移植成功，中途无脱落。治疗有效：对肌强直、震颤等症状改善显著。与移植前相比专业评分有所降低，差异比较明显。治疗无效：对运动迟缓、体位不稳等症状未见改善，主要可能是观察期较短的原因。,东北师范大学,间充质干细胞治疗帕金森病的可能机制,在脑部形成
17、表达神经标志物的神经元样细胞或星形胶质细胞。受中枢神经组织诱导分泌脑源性神经营养因子，刺激损伤部位产生内源性生长因子，促进损伤修复并减少凋亡。是受损部位新生血管的组成细胞，可分化成血管内皮细胞和细胞外基质。在脑内创建适宜的局部微环境，替代受损细胞重建神经功能区和传导通路。,东北师范大学,干细胞治疗中风后遗症,格拉斯哥大学研究人对名缺血性中风患者实施干细胞治疗，将神经干细胞注射到脑损伤部位，接受治疗时已患病半年至年，而中风超过半年的患者通常被认为很难康复。结果显示，名60-80岁患者的神经功能缺损症状持续缓解，其认知、平衡和运动能力均有所恢复，均未出现细胞及免疫方面的不良反应。,东北师范大学,出
18、血性中风与缺血性中风,东北师范大学,骨髓干细胞移植治疗心肌梗死,持续性缺血、缺氧所引起的心肌坏死,东北师范大学,冠状动脉狭窄与手术治疗,东北师范大学,将自体骨髓干细胞通过冠状动脉，移植到梗死或凋亡部位，会转化成具有收缩功能的心肌细胞，解决由于心肌细胞数量减少引起的充血性心力衰竭问题，从而给心脏病患者带来生机。,骨髓干细胞移植治疗心肌梗死,东北师范大学,iPS方法治疗心肌梗死,心肌梗死后成，为避免心脏破损，成纤维细胞迅速在受损部位形成瘢痕。中国学者提出假设，能否用iPS方法直接将瘢痕修复的成纤维细胞转化为心肌细胞，该设想发表于医学假设。美国学者很快就在动物体外和体内试验中证实该假设成立。将3种基
19、因导入新近梗死的瘢痕组织，将成纤维细胞分化为心肌样细胞。,东北师范大学,干细胞治疗心血管疾病,2007年西班牙医生成功地为一名67岁男性患者实施了世界首例心脏间充质干细胞移植术。接受治疗的患者患有严重心绞痛和冠状动脉损伤，搭桥和支架等疗法均无效。医生从患者腹部提取300克脂肪，从中分离间充质干细胞，再通过导管将其植入心脏，病人术后情况良好。,东北师范大学,干细胞体外诱导胰岛细胞,胰岛素释放与血糖含量相关,移植动物血糖下降,Doug MeltonHarvard University,东北师范大学,人干细胞来源的胰岛细胞在小肾小囊内形成胰岛样细胞团及的胰岛素结晶颗粒。,东北师范大学,胰岛素细胞体外
20、大规模培养,东北师范大学,骨髓干细胞治疗椎骨损伤,一名男子20年前颈部严重受伤，胸部以下全部瘫痪。 20年后，医生将受损组织取走后，将骨髓分离的干细胞填充至脊椎受损处。仅仅几周时间，病人大腿慢慢有了知觉。一年以后，他的腿部、后背、腹部能够使劲，并能控制上身活动，甚至可以扶着双杠行走。,东北师范大学,先天性颌面部骨发育不全综合征（Treacher Collin syndrome）治疗方法：分离、培养自体脂肪干细胞，加入分化和生长因子、供体骨支架、骨包被组织等。,5号染色体长臂的5q31.3-q33.3内异常,东北师范大学,烧伤皮肤的传统治疗与干细胞治疗,东北师范大学,干细胞治疗儿童皮肤烫伤,东北师范大学,澳洲学者成功利用干细胞技术，修复受损角膜。患者无须手术，只需戴上特制的隐形眼镜，数周后就能重见光明。由于治疗使用的是患者本身的干细胞，因此不会出现排斥。,干细胞附着在隐形眼镜内壁,3周后受损角膜恢复,东北师范大学,表皮生长因子诱导脂肪干细胞转变为成纤维细胞产生胶原，弹性蛋白及其它皮肤成分。,东北师范大学,脂肪干细胞美容术,东北师范大学,结果不确定的干细胞去皱美容术,东北师范大学,复习题,为何首选M期卵母细胞作为核移植的受体细胞干细胞治疗的特点干细胞治疗机理有哪些你对干细胞治疗的看法,东北师范大学,再 见,
