1、人类辅助生殖技术应用概述,中山大学附属第一医院徐艳文,人工授精夫精人工授精赠精人工授精常规体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET）常规体外受精单精子卵胞质内注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）射出精睾丸/附睾精植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnsosi, PGD）,人类辅助生殖技术,适应证男方因素宫颈因素免疫因素女方排卵障碍不明原因性不孕步骤,夫精人工授精,临床妊娠率10-15%,2010-5-15,中山大学附属第一医院,促排卵治疗
2、,诱发排卵有排卵障碍的情况下以诱发单个卵泡或少数卵泡的发育为目的超排卵在可控制的范围内诱发多卵泡发育和成熟为ART奠定基础治疗的对象很多本身有正常的排卵功能,2010-5-15,中山大学附属第一医院,IUI中促排卵的作用,授精时间更精确纠正排卵障碍提供更多可用的卵子,适应证输卵管盆腔因素子宫内膜异位症排卵障碍经促排卵治疗无效严重少弱畸精症无精症反复IUI失败免疫性不孕,常规体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET）,步骤药物促排卵经阴道穿刺取卵体外授精胚胎培养胚胎移植胚胎冷冻新鲜周期失败后解冻胚胎移植,常规体外受精-胚胎移
3、植in vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET,GnRH激动剂：达必佳，达菲林GnRH拮抗剂：加尼瑞克，思则凯Gn：重组FSH：果纳芬，普丽康尿源性FSH：丽申宝，福特蒙尿源性FSH和LH：贺美奇，HMG,主要药物,促排卵方案-短效长方案,GnRH-a 0.1mg qd,月经第二十天黄体中期,GnRH-a 0.05mg qd,Gn,14-21天,垂体达降调节标准,主导卵泡达18mm时注射HCG，36hr后取卵,促排卵方案-长效长方案,月经第二十天黄体中期GnRH-a 1.3mg单次注射,Gn,14-21天,垂体达降调节标准,主导卵泡达18mm时注
4、射HCG，36hr后取卵,促排卵方案-拮抗剂方案,Gn,主导卵泡达18mm时注射HCG，36hr后取卵,月经第2-3天启动,促排5-6天加拮抗剂,ART临床治疗风险,穿刺并发症 血栓栓塞 妊娠相关并发症 其它风险,经阴道穿刺取卵术并发症,严重并发症（0.5%-1.5%）阴道出血100ml 0.8%盆腔感染 0.6%盆腔脓肿卵巢扭转盆腔出血,卵巢过度刺激综合征,取卵术后卵巢改变,非常脆容易撕裂通过测定Hb和Hct的变化，推测通常取卵术后平均出血量232130 mL,避免在卵巢内横向摆动,卵巢过度刺激综合征（ovarian hyperstimulation syndrome, OHSS）,-促排卵
5、最严重的医源性并发症 -正常妊娠中罕见 *发生率: - 轻度： 8 23% - 重度： 3.5-8% COH - 轻中度：7.3% - 重度： 4.2%,病理及临床表现,体液外渗,毛细血管通透性增加,胸水、腹水、心包积液、全身水肿,低血容量,血液浓缩高凝状态,肾灌注减少,少尿、无尿,电解质紊乱,血栓形成,氮质血症,腹胀、恶心、呕吐咳嗽、气促,卵巢过度刺激综合征（ovarian hyperstimulation syndrome, OHSS）,临床表现卵巢体积显著增大血液浓缩，腹腔积液，胸腔积液少尿电解质紊乱血栓形成、ARDS及多器官功能衰竭,OHSS分度,OHSS分度,根据OHSS发生的时间，
6、又分为早发型OHSS和晚发型OHSS早发型发生在HCG后37天，其发生与卵巢对促性腺激素的反应性有关，并且被外源性HCG激发晚发型HCG后1217天，多伴有多胎妊娠，系内源性HCG所致晚发型OHSS程度往往比早发型严重,体外授精-胚胎移植的实验室步骤,实验室仪器设备实验室质控体外授精胚胎培养胚胎移植胚胎冷冻胚胎解冻,体外授精-胚胎移植的实验室步骤,A、显微操作系统B、程序冷冻仪及液氮罐C、CO2浓度测试仪和温度测试仪D、电子天平，超纯水仪和渗透压仪E、冰箱F、空气净化设备G、CO2和N2，混合气体气瓶,实验室的仪器和设备,1、显微镜A、相差显微镜B、体视镜C、倒置显微镜D、荧光显微镜,实验室的
7、仪器和设备,IVF工作站,实验室的仪器和设备,CO2培养箱：,实验室的仪器和设备,Thermo,K-system G-185,Cook MINC Benchtop Incubator,1、质量控制：温度：233 湿度：30 60%气压： 10Pa尘埃：百级（配子操作区），万级（胚胎实验室），十万级（更衣室，取精室）可挥发有机物（VOC）： 0.5ppm振动，光照及噪音：,胚胎培养实验室的质量控制和管理,2、管理：A、按功能和清洁度分区B、实验室禁止吃，喝，抽烟以及使用化妆品C、培养箱和温台的监测D、冰箱的监测E、液氮罐的监测,胚胎培养环境的质量控制和管理,实验室禁止使用酒精等可挥发性有机物和紫
8、外照射可用蒸馏水擦拭台面可用专用洗涤剂擦拭可能会被污染的台面或者区域可使用吸尘器吸走灰尘培养箱的清洁和消毒,实验室的清洁,1、温度和湿度：37.00.1，90%2、pH：7.1 pHi 7.2， 7.2 pHe 7.43、气体：CO2和O24、渗透压：270 290mOsm/kg,胚胎培养系统,培养基的基本组成水：99%无机盐：维持培养基的渗透压和酸碱度碳水化合物：提供胚胎发育的能量氨基酸：促进胚胎体内外发育维生素：调控细胞代谢激素和生长因子：促进胚胎发育大分子物质：维持胶体渗透压，中和毒素抗氧化剂：减少氧自由基对胚胎的损伤螯合剂：螯合重金属离子抗生素：防止污染,胚胎培养系统,培养液配制和平衡
9、,胚胎培养系统,单气培养：CO2(5-6%)，O2(21%) 和N2(74%)三气培养：CO2(5-6%)，O2(5%) 和N2(90%)优势：更接近生理状态（2-8% O2）,单气培养和三气培养,1、精子的形态结构,精子和卵子,精子形态,精子变态示意图,2、卵子的形态结构,卵母细胞颗粒细胞复合体,GV 期,MI 期,MII 期,异常卵母细胞,1、常规体外授精,体外授精,精卵混合,精卵结合,2、卵胞质内单精子注射（ICSI）,人胚胎体外发育,异常受精,单原核,多原核,三原核,无原核,胚胎发育阶段：卵裂球的数目胚胎形态学评分：胚胎的碎片评分：,卵裂期评分标准,8-1-1,8-2-1,8-2-3,
10、1期：囊胚腔小于胚胎体积的一半2期：囊胚腔大于胚胎体积的一半3期：完全囊胚，囊胚腔与胚胎体积相等,囊胚的发育阶段,1期,2期,3期,4期,5期,6期,4期：扩张囊胚，囊胚腔大于胚胎，透明带变薄5期：孵化囊胚，胚胎部分孵出6期：完全孵化囊胚,胚胎移植数目：35岁以下第一周期：2个35岁以上或者第二周期以上：3个单胚胎移植：,胚胎移植,胚胎移植管装载,胚胎移植管,空气,空气,胚胎,培养基,1、精子冷冻：2、卵子冷冻：3、胚胎冷冻：4、生殖组织冷冻：,配子和胚胎的冷冻及复苏,程序化冷冻（慢速冷冻）玻璃化冷冻（快速冷冻）,冷冻方法,Slow cooling,- 0.3C/min,慢速冷冻法将胚胎放入含
11、有一定浓度的冷冻保护剂处理后，慢速降温（0.23/min ）,在这个过程中，随着细胞外温度的逐渐降低和细胞外冰晶的形成，细胞以一种平衡的方式逐步脱水。直到温度降至-150 ，至于液氮保存。,玻璃化冷冻法采用更高浓度的冷冻保护剂处理细胞，快速降温，使细胞内外的液体均达到玻璃化状态,玻璃化冷冻过程（两步平衡法）在不同浓度的冷冻液中进行平衡,ES,VS,2.装管,3. 投入液氮，在液氮罐中保存。,冷冻前,置入冷冻液后0min,置入冷冻液后4min,置入冷冻液后8min,囊胚冷冻前人工皱缩,皱缩前,皱缩后,控制性超排卵B超监测下取卵体外受精和胚胎培养,胚胎活检对活检的细胞进行检测选择胚胎移植入宫腔,植
12、入前遗传学诊断(PGD),常染色体隐性遗传病-thalassaemiaCystic fibrosisSpinal muscular atrophySickle cell disease,常染色体显性遗传病Huntingtons diseaseMyotonic dystrophyCharcot-Marie-Tooth disease性染色体遗传病Fragile X syndromeDMDHaemophilia,PGD适应证-单基因性疾病,PGD适应证-染色体病,相互易位罗氏易位非整倍体筛查,胚胎活检,卵裂期活检,囊胚期活检,男方45，XY，t(13;14)(p10;q10) 胚胎D 3 FISH结果与D 5/ D 6 array CGH结果对比,非整倍体筛查-SNP芯片,谢谢,
