1、生殖器疱疹和尖锐湿疣的实验室诊断,安徽省皮肤病防治所 樊春举,生殖器疱疹（GH）,（一）概念,生殖器疱疹是由单纯疱疹病毒（HSV)感染泌尿生殖器及肛门部位皮肤黏膜而引起的一种常见的性传播疾病。人类是HSV的唯一自然宿主。生殖器疱疹可呈慢性复发过程，尚无彻底治愈的方法。,HSV是双链DNA病毒，圆形，直径180200nm。中央为病毒核心，含有病毒基因组DNA， HSV-1和HSV-2同源性高达50%，其遗传特性较稳定。表面包被20面体的核衣壳，核衣壳外有来自宿主细胞膜的含有多种病毒特异性糖蛋白的脂质包膜，即包膜糖蛋白。,HSV有两个抗原血清型：即HSV-1和HSV-2。HSV-1主要感染腰以上部
2、位 HSV-2主要感染腰以下部位生殖器疱疹主要由HSV-2感染引起（85%），少量是由HSV-1感染引起（因性行为方式的多样化，口腔与生殖器直接接触），有的可呈混合感染。HSV-1复发率低，HSV-2复发率高。,包膜糖蛋白：,与病毒吸附和入侵宿主细胞、刺激机体产生免疫反应有关。HSV有10 11种特异性糖蛋白抗原，是细胞和体液免疫的主要靶标。 gB gC gD gE gF gG gH gI gJ gL gM gpD：引发中和抗体的能力最强，因此是研制亚单位疫苗的最佳选择。 gG是型特异性糖蛋白，为HSV-1所特有，具有型特异性抗原决定簇，诱导产生特异性抗体。将HSV分为1型和2型。,gB和gD
3、：与特异性细胞受体相互作用的病毒配体分子，与病毒的吸附有关。gE是Fc受体，能与IgG的Fc段结合。gH和gL形成复合物，与病毒入侵细胞有关。,（二）临床表现,生殖器疱疹的潜伏期为220天，平均4 5天。临床表现具有多样性:原发性GH :潜伏期一般3 14日，临床表现为典型的集簇性水疱、脓疱、溃疡及结痂，也可表现为非特异性红斑、丘疹、裂隙和硬结等。病程大约2 3周。男性患者常见受累部位为包皮、冠状沟、龟头和阴茎干。女性多见于大小阴唇、会阴和子宫颈等处。常伴有全身不适感，低热、头痛等全身症状。局部淋巴结肿大。,复发性GH:一般在原发性GH皮损消退后的1 4个月内复发，复发感染一般发生在原来部位。
4、较原发性症状轻，病程短。潜伏性GH：HSV感染者中约80-90%为潜伏感染。潜伏性GH是本病的主要传染源，潜伏的HSV-2较潜伏的HSV-1更易被激发致病。,HSV具有嗜感觉神经节而形成潜伏感染状态的特性，HSV感染生殖器皮肤黏膜后常潜伏在骶神经根区。潜伏感染是生殖器疱疹复发的根本原因。触发潜伏HSV复发的因素： 免疫因素：免疫抑制或免疫缺陷 非免疫因素：激素内分泌因素与物理因素,子宫内感染：经胎盘或宫颈上行感染，导致胎儿早产、流产、畸形和死亡。围产期：经产道40-60%机会被感染。新生儿HSV感染以粘膜损害和内脏疾病为特征。多见于早产儿，特别致命的是脑炎，若不及时治疗，死亡率高达50%以上，
5、后遗症严重。,生殖器感染发病过程,（三）实验室诊断,病原学检测 细胞学染色 细胞培养 抗原检测（EIA/DFA） DNA检测血清学检测,病原学检测,（1）细胞学染色HSV感染细胞，可使细胞产生特征性改变。形成包涵体及多形核细胞，取其染色镜检。方法：吉姆萨、巴氏、瑞氏染色。结果：感染细胞中出现胞浆空泡 细胞融合成多核巨细胞，有 时可见核内包涵体。,方法学评价：此方法简便、快速。敏感性低，细胞学检测的敏感性只有抗原检测法、DNA检测法或病毒分离培养法的50-70%。感染HSV时具有特异性变化的细胞在疱疹或溃疡的基底数量最多，取材时应尽可能取基底部细胞。,原发性生殖器疱疹时，细胞学检查容易成功，皮损
6、早期取材效果较好。随皮损的愈合其病毒数量逐渐减少。此方法不具有特异性，不能区分HSV-1和HSV-2感染，其它疱疹病毒（如水痘-带状疱疹病毒）感染也可引起相似的细胞病变。不主张将细胞学检查应用于生殖器疱疹的临床诊断。,（2）细胞培养法HSV培养的敏感细胞株有宫颈癌细胞（Vero）、非洲绿猴肾细胞（Hela）、乳地鼠肾细胞（BHK）等。原理：HSV为细胞内寄生物，可在某些细胞系 中生长。因此，通过体外细胞培养法可分离检测到HSV。根据HSV感染细胞产生的特征性细胞病变（CPE），能初步确定HSV感染。,方法：1.单层细胞的制备将冻存的细胞从液氮中取出，置37水浴中迅速融化，加入到含有细胞生长培养
7、基的培养瓶中37孵育8小时，待细胞贴壁后换新鲜生长培养基继续培养23天，细胞融合为单层后，弃培养基，用适量的胰蛋白酶溶液于37消化单层4 5分钟，待细胞完全离散后加入生长培养基，配成所需的细胞浓度（大约105/ml）。分装于24孔培养板中，每孔加0.5ml细胞悬液。在37、5%CO2及湿润空气培养1-2天长成单层后即可用于接种。,2.标本接种将标本振荡混匀后接种于易感细胞制成的单层细胞悬液 中，37温箱培养1小时，让病毒充分吸附到细胞上，再在37、5%二氧化碳环境中培养3-7天。每天观察病毒对细胞的致病变效应（CPF)。50%以上细胞出现CPE后，取感染细胞用单克隆抗体的免疫荧光试验或酶免疫试
8、验进行检测和分型。CPE：初始时细胞浆颗粒增粗、细胞变圆，继而肿胀和气球样变，可见融合细胞和多核细胞。,结果：出现典型CPE时报告“HSV初步培养阳性”。荧光检测时阳性细胞的胞浆和核内可见亮绿色荧光。免疫荧光鉴定和分型后报告“HSV培养阳性”同时报告相应的HSV类型。,方法学评价：细胞培养法是HSV检测的金标准方法。耗时较长：通常需2-4天，最长需14天。标本需尽快接种或置-70 冻存。敏感性受多种因素影响：采集的标本中需有感染性病毒颗粒避免杂菌污染标本的来源部位不同，敏感性有差别,（3）HSV抗原检测,是目前最常用的快速诊断方法。HSV抗原检测法均以标记的特异性抗病毒抗体为基础，与待检标本中
9、的抗原结合形成抗原抗体复合物，通过底物显色判断HSV抗原的存在。包括直接免疫荧光试验（DFA）、酶免试验（EIA）及酶联免疫吸附试验（ELISA）。,ELISA方法,将特异性HSV抗体(1、2型)包被在酶标板反应孔上，加入含有HSV抗原的标本及酶标记抗HSV抗体共同体孵育，反应形成抗原一抗体一酶标抗体复合物，在底物作用下产生颜色，颜色的深浅与抗原量成正比。ELISA法方法简单、灵敏度和特异性高等优点。HSV抗原阳性表示HSV现症感染，对症状不典型患者更具诊断意义。不能区分HSV-1和HSV-2感染。可用于单纯溃疡和生殖器疱疹的鉴别诊断。,直接免疫荧光试验（DFA),先将异硫氰酸萤光素(FTTC
10、)与特异性抗HSV抗体结合，在一定条件下再与标本中相应HSV抗原产生反应，形成抗原一荧光抗体复合物，通过荧光显微镜观察复合物发出的荧光，通过荧光判断HSV抗原的存在。 由于组织细胞中存在自然荧光，易出现非特异性结果，每次试验均应设置已知阳性和阴性标本对照。 选择特异性好，质量可靠的抗体，最好选用单抗。 能区分HSV-1和HSV-2感染。,方法学评价：耗时耗力对高危人群有价值，对于无症状患者的标本，敏感性50%。一般用于HSV分离培养阳性标本的鉴定和分型。,HSV-DNA检测法,包括核酸分子杂交技术和聚合酶链反应（PCR）目前商品化的基因诊断试剂盒均选择高保守序列区，主要集中在DNA聚合酶基因区
11、、胸腺嘧啶核苷激酶（TK）基因区和糖蛋白基因区。核酸分子杂交技术：应用DNA分子杂交技术检测HSV-DNA，其敏感性和特异性相当于免疫荧光试验。原理是使用商品化的生物素标记探针，通过原位杂交技术可检测临床标本中的病毒DNA，但操作较为复杂，实验要求较高。,聚合酶链反应（PCR）： 应用PCR体外扩增HSV-DNA片段，可增加HSV检出的敏感性。此法较病毒分离培养法及脑脊液病毒抗体检测更为敏感，且可同时对病毒进行分型。近年来出现的PCR-ELISA或PCR-微孔板杂交法，将PCR技术、核酸杂交技术和酶联免疫技术结合起来，具有很多优点，在检测HSV的同时，还能检测梅毒螺旋体和杜克雷嗜血杆菌，用于以
12、生殖器溃疡为特征的性病的诊断和鉴别诊断。,方法学评价：除ELISA和直接涂片染色方法外，均可区分HSV-1和HSV-2感染。DFA试验时应取溃疡基底部的细胞，尽可能多的获取感染性病毒颗粒。PCR方法是成人及新生儿疱疹性脑膜炎的首选实验室诊断方法。,HSV感染的血清学检测,检测HSV抗体的方法有：检测HSV抗体的方法包括补体结合试验、中和试验、被动血凝试验、间接免疫荧光试验、免疫酶试验、放射免疫试验、ELISA、免疫印迹试验(WBA)。其中许多方法以感染1型和2型毒株的细胞培养物为抗原，难于区分病毒抗体的类型。主要用于回顾性诊断原发性感染，对恢复期或复发性生殖器疱疹的诊断意义不大。,ELISA法
13、检测HSV型特异性抗体原理：用HSV型特异性抗原gG与待检标本中的特异性抗体结合形成复合物，底物显色。方法：同一般的ELISA。不同的是加有标准管，用于计算抗体的相对含量。结果：可用于IgG和IgM的相对定量检测。方法评价：用于HSV感染的诊断，首次感染93%IgM阳性。复发感染IgM阳性在13%以下，同时IgG滴度升高。作为原发和复发疱疹的鉴别。,用于HSV的分型诊断：HSV1和HSV2感染的严重程度和预后存在差异，为预后提供参考依据。用于检出隐性感染者： HSV约有80-90%无症状感染， 可以减少性与母婴传播。用于感染者性伴HSV感染状况的判断,用于HSV感染的血清流行病学调查：为卫生监
14、管部门提供更加有效、可靠的HSV的流行病学数据。用于性病门诊（诊断与高危人群筛查） 产科门诊（孕前和产前筛查，减少新生儿疱疹感染。） 器官移植（检测HSV感染）,免疫蛋白印迹法：原理：使用电泳在结合有HSV-1和HSV-2蛋白的硝酸纤维素膜上反应血清抗体的方法。结果：用于检测复发、未被识别和潜伏感染。方法学评价：优点是能高度准确的检测HSV亚型的感染。缺点是操作复杂。,GH实验室诊断方法的敏感性和特异性比较,方法 敏感性 特异性细胞培养 25-90 99 金标准直接涂片 40-50 95 非特异 DFA 70-95 90-100 抗原gG 抗体检测 90 99 抗体基因检测 95 98-100
15、 基因,进行GH实验室检测的指征男性：阴茎、臀部、会阴有水疱或溃疡淋菌性或非淋菌性尿道炎治疗后排尿困难外阴皮肤反复发作的水疱或溃疡病史女性：生殖器、臀部、大腿有水疱或溃疡粘液或脓性阴道分泌物,外阴及臀部皮肤反复发作的水疱或溃疡病史新生儿：母亲孕期有GH感染或发病史皮肤水疱、结痂。其它情况：与确诊GH患者有性接触史性工作者,尖锐湿疣（CA）,一、概念,是由人乳头瘤病毒（HPV）感染引起的主要发生在肛门生殖器部位的表皮瘤样增生的一种性传播疾病。人是HPV唯一宿主。HPV是乳头瘤病毒科的一种小的双链DNA病毒，具有嗜上皮性。病毒的种间不存在交叉感染，感染为局限性、非系统性的。99.7%的宫颈癌活检组
16、织中有HPV存在，HPV是诱发宫颈癌的重要病原学因素。,乳头瘤病毒的基因组主要编码三组基因三个癌基因，包括E5、E6和E7，负责调节癌细胞转化过程；两个调节基因，包括E1和E2，负责调节转录和病毒基因组的复制；两个结构蛋白基因，包括L1和L2，组成病毒颗粒,HPV 的主要致癌基因 E6 通过抑制 p53而阻断凋亡 E7 通过抑制pRB使细胞周期失控,L1: 主要衣壳蛋白，是疫苗的主要成分,L2: 次要衣壳蛋白，是市售抗体的主要识别位点,E4：结合并破坏细胞角蛋白网，形成挖空细胞的外观,E2：负性调节E6和E7，维持凋亡和细胞周期的调控。通常在病毒发生整合（病毒整合时会破坏E2基因的结构）时失活
17、,二、HPV感染,属于常见的性传播感染 直接的皮肤-皮肤接触是传播的最有效的途径病毒不通过血液或体液传播（例如精液）会阴部的接触是获得HPV的必要条件，而性交并不是必要的,完整的HPV感染循环,HPV感染颗粒突破下肛殖道表皮HPV感染颗粒进入表皮细胞的基底层随着基底层干细胞的子细胞分裂以及在垂直方向上的成熟化，病毒在基底层以上鳞状细胞中复制成熟的病毒在表面细胞分离时释放到环境中,更多的HPV病毒侵入到创口周围组织并进入上皮细胞,HPV病毒通过皮肤表面的微小创口侵入,病毒复制,生殖器HPV感染的潜伏期变化极大。一般来说，生殖器疣在HPV感染36月后显现，然而也有研究表明潜伏期有数个月甚至几十年绝
18、大多数的HPV感染是一过性的，新发感染大多1-2年内会发生自愈仅有少数的HPV感染会保持潜伏性，几年或几十年后会再激活,多数生殖道HPV感染无临床症状 与HPV相关的宫颈疾病包括：宫颈湿疣、宫颈病变和宫颈癌等从HPV感染到释放病毒约有3周。但是，HPV感染至出现损伤之间可能数周到数月。病毒感染的早期可能存在免疫逃逸，故没有炎症反应,目前已发现分离出100多种HPV型，其中约有30多种型与生殖器和肛周感染有关,其中：HPV-6、11、16、18最常引起生殖器疣HPV-16、18、45、56具有高度致癌性HPV-31、33、35具有中度致癌性HPV-6、11的致癌性小，可见于绝大多数的尖锐湿疣,二
19、、临床表现,尖锐湿疣潜伏期3周-8个月，平均3个月。好发于20-40岁性活跃的中青年人群。常发生于性接触时易损伤部位： 男 性：龟头、冠状沟、包皮系带、尿道口、 阴茎部及阴囊 女 性：大小阴唇、阴道口、阴道、宫颈、 会阴、尿道、腹股沟等。,同性恋：好发于肛门及直肠。其 他：口交者发生于口腔，生殖器 以外的部位，腋窝、脐窝、 乳房等处（湿热部位）。,传染方式一、直接性接触传染（主要的传染方式）二、非性接触间接传染： 1、接触物品传染 2、医源性传染 3、母婴传染 4、自体接种传染,皮损特点：典型的临床皮损为乳头状增生性丘疹，质软顶尖，逐渐增多、扩大、融合成乳头状、菜花状、疣状和鸡冠状赘生物。有瘙
20、痒感，触碰有疼痛和易出血。大的皮损（赘生物）有异物感和压迫感。,三、实验室检测,目前HPV感染的实验室诊断方法主要有两大类：一是检查HPV感染的间接证据，例如醋酸白试验或甲苯胺蓝试验、细胞学及组织学检查等。这些方法简便，易于临床开展。二是HPV感染的直接证据，即检查组织中是否有HPV存在。例如免疫组化、核酸分子杂交及PCR检查等。这些方法相对繁杂，临床使用有一定的限制。,（一）醋酸白试验,原理：HPV感染性皮损可产生异种蛋白，此蛋白在3-5%的醋酸作用下可被凝固而呈白色。方法：首先将可疑损害部位或试验部位污染物(或分泌物)去除干净。然后将3-5%的醋酸用棉拭子涂布于皮损表面，或用浸过醋酸液的纱
21、布敷于皮损上进行湿敷，5分钟左右观察结果，肛周皮损则需10-15分钟。,结果观察：HPV感染部位出现白色改变，白色部位为临床可见的可疑损害或出现在临床上未见皮损的部位，直径数毫米至数厘米，形态规则或不规则，边界清，有细小颗粒状突起，是为阳性反应。受试部位或损害涂醋酸后不变白，也没有颗粒状突起时是为阴性反应。,方法学评价：操作简单，无需特殊的仪器设备适用于流行病学研究特异性低 ： 单凭醋酸白试验阳性结果不能肯定就是尖锐湿疣、HPV亚临床感染。醋酸白试验阴性也不能排除尖锐湿疣、HPV亚临床感染,必须通过其他方法检测证实,（二）甲苯胺蓝试验,原理：甲苯胺蓝是一种细胞核染色剂，可停留在细胞核成分较多的
22、组织中。尖锐湿疣病变组织中细胞核大、由于皮肤粘膜的角质蛋白可阻止甲苯胺蓝的穿透性，深染的凹空细胞可使着色的甲苯胺蓝不易被清除掉，因此可用于尖锐湿疣的诊断与鉴别诊断。,方法： 试剂配制：1甲苯胺蓝染色液配制：取甲苯胺蓝粉1小勺，10醋酸液10ml，无水酒精4ml，加蒸馏水86ml而成。1醋酸脱色液配制：取1醋酸液10ml，无水酒精4ml，加蒸馏水86ml而成。,先用浸透蒸馏水或生理盐水的纱布清理干净受试部位（注意不要擦破表皮），用棉签蘸1甲苯胺蓝染色液，均匀涂在受试部位及其周围的皮肤粘膜上染色。待染色液干燥后，再用1醋酸脱色液擦洗被染色部位，并观察已染色的部位是否脱色。,结果： 甲苯胺蓝试验阳性
23、表现为用脱色液后蓝色染料清除仍保留为深蓝色者。表明是尖锐湿疣或是其亚临床表现。 甲苯胺蓝试验阴性表现为用脱色液后蓝色染料被清除掉或仅呈淡蓝色者。排除尖锐湿疣或其亚临床表现。,（三）HPV巴氏涂片细胞学检查,原理：通过观察外生殖器和或肛门等部位脱落的上皮细胞或尖锐湿疣病变组织染色后细胞形态的变化，以判断是否有尖锐湿疣亚临床表现或尖锐湿疣。方法：取患者分泌物、采用病灶刮片或用生理盐水磨擦病灶涂片、尿道口印片，以获取脱落的上皮细胞，待自然干燥后，经染色进行细胞学检查。,操作步骤：固定：待涂膜自然干燥后，将涂片置乙醇乙醚固定 液中固定30分钟以上。加水：将涂片依次浸入80%、70%、50%乙醇中各30
24、秒，后置入蒸馏水中至少2分钟。苏木素染色：将涂片置于苏木素染液中510分钟，取出后水洗。分化：将涂片浸入0.5 %1%稀盐酸数秒，洗去多余的染液，水洗去除酸。,蓝化：置于碳酸锂或稀氨水中染色1分钟，取出后水洗5分钟。脱水：依次置于50%、70%、80%及95%乙醇中30秒至1分钟进行脱水，在95%乙醇中脱水2次。浆染：橘黄G6中染色2分钟后，在95%乙醇中浸洗2次；再浸入EA36染液中染2 4分钟，用95%乙醇浸洗2次洗去多余染液。脱水：置于无水乙醇中2分钟。透明：置于二甲苯中2分钟。封片镜检：用中性树胶封片，镜检。,结果：在涂片中可以见到两种细胞，一种细胞的核周围有晕环，它占据了细胞浆的大部
25、分，而将细胞浆压缩到边缘呈浓缩状，此种细胞称为空泡化细胞，它来源于浅层的鳞状上皮细胞。另一种细胞称为角化不良细胞，可单个或成堆分布，特征为细胞深伊红染色，核小而致密浓染。 此外，有时还可见到病毒包涵体，病毒包涵体的特征为在脱落的上皮细胞核内或核旁胞浆内可见圆形、椭圆形大小不等均质浓染质块。,凹空细胞：凹空细胞主要见于表皮浅层和或棘细胞全层。典型的凹空细胞的形态有以下特点：细胞体积大，核大，单核或双核；染色深，核变形或不规则，轻度异形性，核边缘不齐，呈所谓“毛毛虫”状细胞核周围有空晕，为环状核周胞浆空化，少量胞浆围绕细胞核周围呈放射状细丝样贴附细胞核膜细胞边缘尚存带状胞浆,越向表皮浅层凹空细胞之
26、胞浆空泡化越明显，且细胞体积亦越大凹空细胞群集存在，但无细胞间水肿。这种变化与一般细胞水肿或空泡变性不同，后者成群存在，常伴有细胞水肿，而且无核肥大变化,方法学评价：细胞检查找到凹空细胞对诊断尖锐湿疣有重要意义。有报道涂片细胞学检查的特异性达90，但其敏感性差，对HPV感染者只有15-50为阳性。尽管凹空细胞出现在有HPV生殖道感染中具有诊断意义，但有许多HPV感染的组织、特别是哪些HPV潜伏感染的组织不出现凹空细胞。,（四）HPV细胞抗原检测,包括免疫荧光和免疫组化两大类免疫荧光法需荧光显微镜，切片结果不能长久保存，一般应用较少。免疫组化法是主要用于检查HPV抗原(HPV衣壳抗原)的方法。该
27、方法采用的技术包括抗生物素蛋白生物素轭合物法(ABC法) 、过氧化物酶-抗过氧化物酶法(PAP法)等，对HPV抗原进行免疫组化染色后观察结果。,原理：（过氧化物酶抗过氧化物酶法PAP法为例）HPV感染人体表皮细胞后，在细胞内增殖合成衣壳蛋白而成为HPV抗原成分。受检标本首先与抗HPV抗体（一抗）孵育，标本中的HPV抗原与抗体结合，然后再加入抗一抗的抗体（二抗）及PAP复合物，二抗一方面与一抗相连，同时也与PAP复合物相连，此时在显色剂存在的情况下，可出现显色反应，由此判断标本内是否有HPV感染。,方法：常规石蜡切片或冰冻切片，加3%H2O2处理，以除去内源性过氧化物酶活性，防止假阳性或背景染色
28、深的现象。切片加正常血清，以封闭不必要的抗原。加抗HPV抗体，室温孵育30分钟，PBS缓冲液洗。加二抗，室温孵育30分钟，PBS缓冲液洗。加PAP试剂，室温孵育30分钟，PBS缓冲液洗。,加显色剂，氨乙基咔唑（AEC）显色5 15分钟，蒸馏水洗。经苏木素染色1 5分钟，蒸馏水洗。将切片置氨水中浸数次，水洗。甘油明胶封片，普通显微镜下观察。,结果：在光学显微镜下见到胞核内有棕黄色微细均匀颗粒为阳性细胞，即HPV抗原检查阳性。阳性细胞多位于表皮棘层中上部，多呈散在灶状分布。这些阳性细胞都是诊断性凹空细胞。,CA的免疫组化检查,方法学评价：免疫组化法检查HPV抗原阳性对诊断HPV感染或尖锐湿疣具有重
29、要意义。由于HPV抗原免疫组化方法只能确认细胞核的衣壳蛋白，此衣壳蛋白仅出现在HPV生活周期中的一个阶段(在后期病毒颗粒中产生)，即抗原呈周期性表达，病变程度不同抗原量表达也不同，同时，这种方法需要大量病毒颗粒才出现阳性反应，此外，在制片过程中的处理也会使一些抗原丧失，故免疫组化法检出率较低，据一些资料报道HPV抗原检查的阳性率为48.967.3。,（五）组织病理学检测,原理：取病变组织制片后在光学显微镜下或电子显微镜下观察其组织结构和细胞学变化。方法：病理切片，制片后同前述细胞学和抗原学方法读片。结果：组织病理变化主要为表皮角化不全，棘层高度肥厚，表皮突增宽、延长，呈乳头瘤样增生，粒层和棘层
30、上部细胞有明显的空泡形成，棘层基底细胞有相当数目的核分裂，颇似癌变，但细胞排列规则，表皮与真皮之间界限清楚。,CA的病理切片图（HE染色）,方法学评价：在实验室检测中，组织病理学检查是一种非常重要的检查方法，对尖锐湿疣诊断与鉴别诊断具有十分重要的意义。 普通性病实验室难开展，需病理实验室协助。须有典型的临床表现（有赘生物出现）创面大，病人接受程度有差别。,（六）HPV抗体检测,HPV抗体检测阳性率为50-90%，因为有部分人群感染HPV后并不能产生HPV抗体。HPV抗体检测阳性只代表曾经感染过HPV，并不代表现在HPV感染状态。,研究表明，由于HPV亚型繁多以及人体对HPV免疫应答差异很大，抗
31、体检测法的阳性率和特异性都不理想。妇女中有20%-50%的人呈 阳性而不能检出型特异性抗抗体,可能是由于被感染者过期抗体效价已下降。随访研究证实, 检出后6-18个月间常发生血清转移。短暂 检出病例罕见抗HPV抗体。因此，很多学者认为HPV抗体检测意义不大。,（七）HPV-DNA检测,包括HPV核酸分子杂交技术和基因芯片技术HPV核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术是利用高特异性及高灵敏度的用同位素或生物素标记的HPV-DNA标记探针，与待测标本在一定条件下进行杂交来判定标本中是否存在互补的核酸链，以确定HPV -DNA。传统所用方法主要有斑点杂交法、原位过滤杂交法、Southern印迹法等。此技
32、术操作繁杂耗时，随取材部位和病变时间变化对检测灵敏度产生较大影响。,（1）杂交捕获法杂交捕获(hybridcapturesystem，HCS) 实验，其原理是利用对抗体捕获信号的放大和化学发光信号的检测。敏感性好，重复性高，不存在交叉杂交问题。,（2）反向杂交法有线性平行杂交，点杂交，反向线性杂交常用于HPV型别分布的统计研究中（3）以聚笨乙稀磁铁珠为载体的多重HPV分型方法杂交载体是磁珠，通用引物行广谱扩增，加入变性剂，产物解为单链，与磁珠上型别特异性探针杂交反应。,杂交捕获法杂交捕获一代（HC-)试验可检测9 种高危型HPV ,包括16 、18 、31 、33 、35 、45 、51 、5
33、2 和56 。所用的反应载体是试管杂交捕获二代试验(HC)原来的试管法改为96 孔平板法，能同时检测13 种高危型HPV (16 、18 、31 、33 、35 、39 、 45 、51 、52 、56 、58 、59 和68) 。,基本实验步骤如下： 1. 样本DNA 双链被释放并分解为核苷 酸单链; 2. DNA 单链与RNA 探针结合为RNA DNA 杂交体; 3. 特异性抗体将RNADNA 杂交体固定 在试管壁或微孔壁上; 4. 结合有碱性磷酸酶的多个第二抗体与 RNADNA 杂交体结合,使信号放大; 5. 碱性磷酸酶使酶底物发光,判读光的强弱 可确定碱性磷酸酶的含量,从而确定RNA
34、DNA 杂交体的含量。,DNA裂解 RNA-DNA杂交 抗体捕获 化学发光 计算机判读,基因芯片技术新发展的一项诊断技术，在HPV分型中用寡核苷酸原位合成法，原理是将疾病的特征性基因片段或致病病原体片段固定芯片上，制成诊断芯片，提取患者样本中核酸行标记作探针，利用探针与芯片杂交，扫描杂交结果，判断基因型分型是否被感染，可诊断HPV潜在感染，行早期预防,方法学评价：目前认为PCR技术是检测HPV DNA及分型的最好方法。特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对待检原始材料质量要求低需特定的仪器设备和试剂,成本相对较高操作步骤及工作环节多,极易产生污染和误差使得检测结果假阳性率增高是一种定性诊断方法,不能完全反映出患者的感染水平和病情进展状况,小结,由于HPV不能进行组织培养和细胞培养，也不能在实验动物中生长，因而给尖锐湿疣和HPV感染的诊断和研究带来许多困难。尖锐湿疣主要判断方式是临床观察病变，仔细观察有无赘生物的生成，实验室检查是种辅助手段。有一些重要的实验室检查对尖锐湿疣的诊断与尖锐湿疣的鉴别诊断有一定的帮助。,谢谢,
