1、色素上皮衍生因子（PEDF）在膀胱癌中的表达及其对膀胱癌治疗作用的研究 一、趋势判断和需求分析国内外现状、水平和发展趋势（含知识产权状况和技术标准状况）；经济建设和社会发展需求；科学技术价值、特色和创新点。膀胱癌是危及人类健康的重大疾病，全世界范 围内统计其 发病率占全身肿瘤的第 8 位，在男性其 标准发病率 9.9/10 万；在女性，其标准发病率为 2.3/10 万，占第 25 位。死亡率在男性为 4.2/10 万，占全身肿瘤死亡率的第 9 位，在女性为 1.1/10 万，占第 16 位。在我国,膀胱癌也是泌尿外科的最常见恶性肿瘤，占全身恶性肿瘤的 3.2%，1995 年，北京市城区膀胱癌发
2、病率大约为 7/10 万人，上海市城区 发病率为 8.6/10万人1，且今后 发病率仍有上升趋势。作为危害人类健康的常见恶性肿瘤，膀胱癌发病机制和治疗方面的研究始终是临床基础研究的重点之一。目前膀胱癌的治疗仍以手术切除为主， 辅以膀胱灌注化 疗和免疫治疗、全身化 疗、放疗和生物治疗等措施, 但这些治疗方法效果都不满意，主要是治疗后易复发，复发率高达 80%，其中大约 16%-25%复发的肿瘤其恶性程度增加，有 10%发展为浸润性或转移性癌，因此,寻找一种新的、更有效的生物治 疗方法，是当前临床迫切需要解决的问题。在膀胱癌的这些辅助性治疗方法中，无 论是化疗还是免疫治 疗，主要机制是通 过直接杀
3、死肿瘤细胞、阻断肿瘤细胞分裂或诱导细胞调亡的方式来抑制肿瘤生长。做为一种实体性肿瘤生长， 肿瘤细胞的增殖固然重要，而新生血管的形成在肿瘤的生长和复发、 转移过程中也 发挥非常重要作用。在正常状态下，人体内的脉管系统在血管生长因子和抑制因子网络式的相互作用下处于平衡状态；病理状态下，尤其是发生恶性肿瘤时，这种平衡向血管生成的方向 发展。当 肿瘤生长达到 肿瘤组织超过 2mm 时就会有新生血管形成，如果没有新生血管生成，肿瘤生 长明显受到抑制，甚至停止2 ，3。抗血管生成疗法是不同于目前常规疗法的新的肿瘤治疗策略，具有高效低毒和不易 产生耐药性的特点 4。有关血管生长因子和血管生长抑制因子在肿瘤中
4、所起作用，以及通 过抗血管生成治疗肿瘤已经 成为当前肿瘤研究的一个热点。近来研究发现，色素上皮衍生因子（ pigment epithelium derived factor, PEDF）是一种对肿瘤有抑制作用的细胞因子。这种细胞因子是 Tombran-Tink 等在实验中发现的，由人视网膜色素上皮细胞分泌的一种蛋白质，分子量为 50 KD5，属于 serpin 卵白蛋白/PAT-2 亚群，其基因全长 16 kb，位于染色体 17p13.1-pter 6 。 多项研究表明，PEDF 是一种天然的高效的新生血管抑制剂7，并通过诱导肿瘤细胞分化起到抑制肿瘤生长的作用。Tombran-Tink 等将
5、PEDF 基因定位于染色体 17p13.1,肿瘤发生与该区域关系密切，提示该基因可能是抑癌基因或肿瘤相关基因5。对肿瘤细胞进行编码 PEDF 的腺病毒转染，在血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）存在的情况下，PEDF 明显阻止了血管内皮细胞管腔形成和迁移。对患有 CNV/AMD 患者的体外实验也发现， PEDF 大量减少的情况下，内皮 细胞有明显迁移;而对照组含有正常水平 PEDF,则抑制了内皮细胞的迁移6 。Crawford 等发现 PEDF 在神经母细胞瘤中是肿瘤细胞分化调控的主要的抗血管生成的抑制剂7 。肝癌患者血管增生和肿瘤
6、发展中， PEDF 作为 VEGF的拮抗因子，起到了抑制作用。对裸小鼠的在体实验以及鼠的肺癌模型也同样证明了 PEDF 对肿瘤的抑制作用。其机制乃因 PEDF 减少肿瘤微血管的密度，因而可被用于抑制肿瘤新生血管形成，从而抑制肿瘤的生长，在肿瘤的治疗前景上非常 乐观8。我们最近对 PEDF 在膀胱癌中表达情况的初步研究发现，PEDF 在膀胱癌组织中表达明显低于正常膀胱组织，而且 PEDF 表达情况与膀胱癌的恶性程度以及癌组织中微血管密度呈负相关，提示 PEDF 在膀胱癌的发生、发展中具有一定的作用，PEDF 的正常表达可能抑制膀胱癌细胞的生长、增殖， PEDF 有可能成为膀胱癌生物学治疗的一种有
7、效的新方法。目前国内、外尚未见此项研究的相关报道。因此我们设想，扩大样本量，应用分子生物学技 术检测膀胱癌组织及非癌膀胱 组织中 PEDF 的表达水平， 进一步研究PEDF 在膀胱癌中的表达情况，并结合临床资料分析 PEDF 表达与膀胱癌分期、分级、转移及预后的关系；通过研究膀胱癌组织中 PEDF 与 VEGF 表达的相关性，PEDF 与血小板反应素-1 表达的相关性，探讨膀癌组织中 PEDF 表达与 肿瘤血管形成的相关性及可能的作用机制；通过研究 PEDF 表达与金属蛋白酶-9（MMP-9）的相关性，探 讨 PEDF 表达与膀胱癌浸润的相关性；通 过研究 PEDF 表达与已知的对肿瘤生长有明
8、确调节作用的肿瘤坏死因子 （TNF-）、白 细胞介素 1（IL-1）、血栓调节蛋白（thrombomodulin）和白介素 8（IL-8）等细胞因子表达的相关性，探讨 PEDF 表达对膀癌细胞调节的可能机制，从而探讨 PEDF 在膀胱癌发生、发展过程中的可能作用机制；在此基 础上，以连接有 PEDF 编码基因的腺病毒载体转染膀胱癌细胞株、以 PEDF 蛋白治疗裸鼠膀胱癌模型， 进一步探讨 PEDF 表达对膀胱癌细胞生长的抑制作用以及对膀胱癌的治疗效果,为膀胱癌的生物学治疗探索一种有效的新方法。参考文献2 吴阶平， 吴阶平泌尿外科学，山东科学技术出版社， 2004.5：898-917二、研究内容
9、和技术关键研究的总体目标：(1) 研究 PEDF 表达与膀胱癌的发生、分期、分级、 转移及预后的关系，探讨 PEDF 表达在膀胱癌发生、发展及转移过程中可能的作用机制。(2) 研究 PEDF 对膀胱癌细胞的治疗效果，为临床治疗膀胱癌的生物治疗探索一种新的有效方法研究的创新点：本课题研究的内容和思路不同于以往的其他研究，应用分子生物学方法从研究 PEDF 表达与膀胱癌的发生、分期、分级、转移及预后的关系入手，探 讨 PEDF 表达在膀胱癌 发生、 发展和转移中可能的作用机制。在此基础上，以连接有 PEDF 编码基因的腺病毒载体转染膀胱癌细胞株、以 PEDF 蛋白治疗裸鼠膀胱癌模型，探讨 PEDF
10、 对膀胱癌的治疗作用。目前，本项研究国内、外尚未见报道。本研究的 顺利完成，将为膀胱癌的生物学行为的研究开辟了新的途径，也将为膀胱癌的生物学治 疗探索一种新的有效方法。研究的主要内容：(1) 膀胱癌组织和非癌膀胱组织中 PEDF 和相关细胞因子表达的检测及相关性研究：应用分子生物学技术研究膀胱癌组织和非癌膀胱组织中 PEDF 表达状况，并检测 VEGF、TSP-1、MMP-9、TNF-、IL-1、血栓 调节蛋白（thrombomodulin）和 IL-8 的表达状况；采用免疫组化技术检测膀胱癌组织和非癌膀胱组织中的微血管密度（microvascular density，MVD），分析 PEDF
11、 与 VEGF、TSP-1、MMP-9、TNF-、IL-1、血栓 调节蛋白和 IL-8 表达的相关性，PEDF 与 MVD 的相关性；并结合临床资料分析研究 PEDF 表达与膀胱癌患者 5 年生存率之间的关系；阐明 PEDF 表达与膀胱癌的发生、分期、分级、转移及预后的关系，探讨 PEDF 表达在膀胱癌发生、 发展中的可能机制。(2) PEDF 对膀胱癌细胞株的治疗：以连接有 PEDF 编码基因的腺病毒载体转染膀胱癌细胞株,以空载转染膀胱癌细胞株作为对照，观察检测 VEGF、TNF- 的表达情况及膀胱癌细胞的凋亡、增殖情况。(3) PEDF 对裸鼠膀胱癌模型的治疗：以人膀胱癌细胞种植于裸鼠皮下
12、，建立裸鼠膀胱癌模型。以 PEDF 蛋白（购自吉泰生物科技有限公司）直接注射于裸鼠皮下肿瘤组织内作为治疗组，以未注射 PEDF 组为阴性对照组。 观察各组的MVD、VEGF 及肿瘤增殖情况，探 讨 PEDF 表达在膀胱癌发生、发展中的作用机制，评估 PEDF 对膀胱癌的治疗效果，为进一步过度到 临床应用提供依据。需要解决的技术关键：(1) 连接有 PEDF 编码基因的腺病毒载体转染膀胱癌细胞株的转染成功率。(2) PEDF 定量 检测：我们已有 对前列腺癌、肾癌、膀胱癌等组织标本的 PEDF 定量分析的基础，已形成较成熟技术条件、设备和研究 经验。(3) 膀胱癌裸鼠模型的构建。我们已有成功构建
13、裸鼠膀胱癌和前列腺癌模型的经验。研究方法：方法（1）膀胱癌组织和非癌膀胱组织中 PEDF 和相关细胞因子表达的检测及相关性研究：实验组 对照组膀胱癌组织 非癌膀胱组织标本A 期 B 期 C 期 D 期癌旁膀胱组织正常膀胱组织炎性膀胱组织例数 30 30 30 30 120 120 120 应用 SYBR Green I 实时定量聚合酶链反应（real-time PCR）技术,对膀胱癌、非癌膀胱 组织中 PEDF进行定量测定。 Western blot 法检测 VEGF、TSP-1、MMP-9。 ELISA 法检测 TNF-、IL-1、血栓调节蛋白、IL-8 浓度。 免疫组化方法检测标本 MVD
14、。 整理临床资料：膀胱癌患者性别、年龄、组织病理、分期、分 级、是否 转移、5 年生存率。 数据统计分析(使用 SPSS统计分析软件)：PEDF 与 VEGF 表达的相关性。PEDF 与 TSP-1 表达的相关性PEDF 与 MMP-9 表达的相关性PEDF 与 TNF-、IL-1、血栓调节蛋白、 IL-8 浓度的相关性。PEDF 与组织 MVD 相关性。PEDF 与膀胱癌分期的相关性。PEDF 与膀胱癌恶性程度（分级）的相关性。PEDF 与膀胱癌转移的相关性。PEDF 与膀胱癌 5 年生存率的相关性。方法（2）PEDF 对膀胱癌细胞株的治疗：以连接有 PEDF编码基因的腺病毒载体转染膀胱癌细
15、胞,以空载转染膀胱癌细胞作为对照，检测VEGF、TNF-浓度，观察细胞的增殖、凋亡情况，分析相关性。 以 RT- PCR 法扩增 PEDF 基因。 将扩增后的 PEDF 基因连接入腺病毒载体， 转染膀胱癌细胞。并以空载转染为对照。 Western blot 法检测 VEGF、TSP-1、MMP-9 表达。 观察膀胱癌细胞增殖、侵袭、凋亡情况。 统计分析。方法（3）PEDF 对裸鼠膀胱癌模型的治疗：以人膀胱癌细胞种植于裸鼠皮下，建立裸鼠膀胱癌模型。以 PEDF 蛋白直接注射于裸鼠皮下肿瘤内作为治疗组，以未注射 PEDF为阴性 对照组。 观察两组膀胱癌 组织 MVD、VEGF 表达情况、肿瘤增殖情
16、况，评价 PEDF对膀胱癌的治疗效果。 以人膀胱癌细胞种植于裸鼠皮下构建膀胱癌裸鼠模型。 将 PEDF 蛋白注射于裸鼠瘤体内。 应用免疫组化方法检测 MVD；应用 Western blot 法检测 VEGF、TSP-1、MMP-9；观察肿瘤增殖、凋亡情况。分析 PEDF 与 VEGF 的相互作用关系及其对肿瘤生长的作用机制。技术路线：(1) 膀胱癌组织和非癌膀胱组织中 PEDF 及相关细胞因子表达的检测及相关性研究：膀胱癌标本120 例癌旁膀胱组织标本 120 例RT-PCR 检测 PEDF mRNA 表达Western blot法 检测VEGF、TSP-1、MMP-9ELISA 法检测 TN
17、F-、IL-1、血栓调节蛋白、IL-8 浓度免疫组化方法检测标本微血管密度（MVD）结合临床资料，数据统计分析正常膀胱组织标本 120 例炎性膀胱组织标本 120 例(2) PEDF对膀胱癌细胞株的治疗：将 PEDF转染膀胱癌细胞株，检测 VEGF、TSP-1、MMP-9、TNF-浓度，观察肿瘤细胞的增殖、凋亡情况。RT PCR 法扩增 PEDF 基因连 接入 腺病毒载体转染膀胱癌细胞株空载体观察细 胞凋亡、增殖情况ELISA 法检测 TNF-Western blot 法检测 VEGF、TSP-1、MMP-9 表达结果分析(3) PEDF对裸鼠膀胱癌模型的治疗：观察 PEDF 与 VEGF、M
18、VD 相关性及其 对膀胱癌细胞的抑制作用构建膀胱癌裸鼠模型注射 PEDF 蛋白观察微血管密度（MVD）VEGF、TSP-1、MMP-9 定量测 定肿瘤凋亡、增殖、侵袭 情况未注射（对照）结果分析先后开展了膀胱癌、前列腺癌等的一系列基础研究（包括分子生物学研究）和 临床研究，如：裸鼠膀胱癌模型的建立、CD44 基因、端粒酶、P53 和 Ras 基因等表达与膀胱癌的关系、VEGF 表达与膀胱癌的关系等，熟练掌握了泌尿生殖系 统肿瘤分子生物学和细胞学研究的技 术方法，如 RT-PCR、southern 、northern 杂交、DNA 测序、拥有独立的泌尿外科免疫、病理、分子生物学和细胞学实验室，实
19、验室设备完善，技术方法先进，拥有 PCR-扩增仪、 酶标仪、各种 电泳槽、凝胶成像设备、细胞房及各种基础实验设备等,为本课题的顺利进行提供了有力的技术和仪器设备保证。细胞培养、腺病毒 载体构建等技术，积累了较丰富的研究经验。 最近我们开展了对膀胱癌、前列腺癌 组织中 PDEF 表达的初步研究，掌握了 对肿瘤组织包括膀胱癌组织中 PDEF 表达的 检测方法，对本课题的顺利进行提供了便利条件。例如：已完成对膀胱肿瘤与正常膀胱组织 PEDF 表达情况的 对照性研究，初步结果显示如下:(1) 定量 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳结果可见：PEDF 在正常膀胱组织中高表达, 而在膀胱癌组织中表达明显降低（见
20、图 1）。 (2) 图 1：正常膀胱组织与膀胱癌组织 PEDF 定量 PCR注：N1，N2，N3：正常膀胱 组织T1，T2，T3：膀胱癌组织GAPDH：内参照M：为标记分子量(2)在膀胱癌组织中 PEDF 低表达与微血管增殖相关（见图 2）。预期成果：（1）明确测定出 PEDF 在膀胱癌中的表达情况以及其与相关细胞因子表达之间的关系。（2）PEDF 在膀胱癌 发生、发展过程中起重要作用。（3）PEDF 对膀胱癌的治 疗有效，为最终过渡到临床应用提供强有力的实验依据。成果以论文的形式表达，并申 请“ PEDF 治疗裸鼠膀胱癌模型技 术”的专利；拟发表论著 57 篇，其中国内权威杂志 45 篇，S
21、CI 收录杂志 2 篇。申 请成果鉴 定。本课题实施过程中，形成一整套的 细胞因子检测方法、膀胱癌细胞株培养及腺病毒转染膀胱癌细胞技术、裸鼠膀胱癌模型的建立及 PEDF 治疗裸鼠膀胱癌模型等方法，将为复旦大学泌尿外科研究所的分子生物学实验室和细胞学实验室提供新的研究条件和技术，并为以后此类研究的开展奠定扎实基础。本课题研究过程中，拟培养硕 士研究生 2 名，博士研究生 2 名，技术员一名。六、预期效果和风险分析课题成果对社会发展所起的作用；经济效益和产业化前景（预计年产值、年利润、年节汇 、年 创汇 、年 节能等）；对环境影响程度及资源综合利用情况；可能的技术风险；可能的市场风险。本课题通过对
22、对膀胱癌组织和非癌膀胱组织中 PEDF 表达和相关细胞因子的检测，探讨 PEDF 表达对膀癌细胞调节的可能机制，从而探 讨 PEDF 在膀胱癌发生、 发展过程中的可能作用机制；在此基础上，以连接有 PEDF 编码基因的腺病毒载体转染膀胱癌细胞株、以 PEDF 蛋白治疗裸鼠膀胱癌模型，进一步探讨 PEDF 表达对 膀胱癌细胞生长的抑制作用以及对膀胱癌的治疗效果。本课题的的顺利完成，不 仅为膀胱癌发病机制的研究提供了新的线索，而且，为膀胱癌的生物学治疗探索了一种有效的新方法，并 为最终过渡到临床应用提供强有力的实验依据，具有 较好的经济效益和社会效益。本课题的进行不会造成对环境的污染，并充分利用 现有的 综合资源包括：泌尿外科研究所的的实验室、仪器设备、已积累的组织标本和病例 资料、已 经进行的与本 课题有关的预实验基础等。可能的技术风险主要是：连接有 PEDF 编码基因的腺病毒载体转染膀胱癌细胞株的转染成功率和 PEDF 对裸鼠膀胱癌模型的治疗效果。
