1、生物 选修三知识点基因工程的诞生（三个理论和三个技术）：基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科基础上发展起来的，正是这些学科的基础理论和相关技术的发展催生了基因工程，具体有三大理论发现和三个技术突破。1) 理论基础：DNA 是遗传物质； DNA 分子的双螺旋结构和半保留复制；遗传密码的通用性和遗传信息传递的方式；2) 技术基础：限制性核酸内切酶的发现与 DNA 的切割； DNA 连接酶的发现与 DNA 片段的连接；基因工程载体的构建与应用 理论上的三大发现 、发现了遗传物质DNA1944 年，艾弗里（O.T.Avery）的肺炎双球菌转化实验、揭示了遗传物质的分子机制：DNA 分子的双
2、螺旋结构和半保留复制1953 年，沃森（J.D.Watson）和克里克（F.Crick）的 DNA 双螺旋结构模型、半保留复制图，获 1958 年诺贝尔奖。、确立了遗传信息的传递方式：以密码形式传递1963 年，美国尼伦伯格（M.W.Nirenberg）和马太（H.Matthaei）确立了遗传信息以密码形式传递，破译了编码氨基酸的遗传密码(3 个核苷酸=1个密码子=1 个 aa)。 技术上的三大突破、世界上第一个重组 DNA 实验：实现不同来源 DNA 的体外重组1972 年斯坦福大学化学家伯格（P.Berg）借助内切酶和连接酶将猴病毒 SV40 的 DNA 和大肠杆菌 噬菌体的 DNA 在试
3、管中连接在了一起，第一次成功地实现了 DNA 的体外重组。、第一个基因克隆实验：重组 DNA 表达实验，是世界上第一个基因工程实验1973 年美国斯坦福大学医学院遗传学家科恩（S.Cohen）将体外构建的含有四环素和卡那霉素抗性基因的重组质粒导入大肠杆菌，获得了具有双抗性的大肠杆菌转化子，成功完成了第一个基因克隆实验。是基因工程诞生的标志。、第一个真核基因在原核生物中的表达：第一次实现了异源真核基因在原核生物中的表达1974 年，科恩（S.Cohen）和博耶（H.Boyer）将非洲爪蟾编码核糖体基因的 DNA 片断同 pSC101 质粒重组，并导入大肠杆菌细胞，结果表明动物基因已进入大肠杆菌并
4、转录出相应的 mRNA 产物，第一次实现了异源真核基因在原核生物中的表达。专题 1 基因工程基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外 DNA 重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在 DNA 分子水平上进行设计和施工的，又叫做 DNA 重组技术。（一）基因工程的基本工具1.“分子手术刀”限制性核酸内切酶（限制酶）（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。（2）功能：能够识别双链 DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。（3）结果：经限制
5、酶切割产生的 DNA 片段末端通常有两种形式：粘性末端（EcoRI 酶）和平末端(SmaI 酶)。2.“分子缝合针”DNA 连接酶(1)两种 DNA 连接酶（EcoliDNA 连接酶和 T4-DNA 连接酶）的比较：相同点：都缝合磷酸二酯键。区别：EcoliDNA 连接酶来源于 T4 噬菌体，只能将双链 DNA 片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而 T4DNA 连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。(2)与 DNA 聚合酶作用的异同:DNA 聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA 连接酶是连接两个 DNA 片段的末端，形成磷酸二酯键。3
6、.“分子运输车”载体（1）载体具备的条件：能在受体细胞中复制并稳定保存。具有一至多个限制酶切点，供外源 DNA 片段插入。具有标记基因，供重组 DNA 的鉴定和选择。（2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状 DNA 分子。（3）其它载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒(二)基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的获取1.目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因 。2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。从基因文库(基因组文库或 cDNA 文库)中获取人工合成目的基因:常用的
7、方法有化学合成法和 反转录法。3.PCR 技术扩增目的基因（1）原理：DNA 双链复制（2）过程：第一步：加热至 9095DNA 解链；第二步：冷却到 5560，引物结合到互补 DNA 链；第三步：加热至 7075，热稳定 DNA 聚合酶从引物起始互补链的合成。第二步：基因表达载体的构建（最核心步骤）1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。2.组成：目的基因启动子终止子标记基因（1）启动子：是一段有特殊结构的 DNA 片段，位于基因的首端，是 RNA 聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出 mRNA，最终获得所需的蛋白质。（2）终止子：也
8、是一段有特殊结构的 DNA 片段 ，位于基因的尾端。（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。提醒： 与载体相比较,增加启动子、目的基因和终止子三个基因片段,其功能各不相同。 启动子(DNA 片段)起始密码子(RNA);终止子(DNA 片段)终止密码子(RNA)。第三步：将目的基因导入受体细胞_1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2.常用的转化方法：将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 农杆菌转化法，其次还有 基因枪法和 花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用
9、的方法是 显微注射技术。此方法的受体细胞多是 受精卵。将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 ，最常用的原核细胞是 大肠杆菌 ，其转化方法是：先用 Ca 2+ 处理细胞，使其成为 感受态细胞 ，再将 重组表达载体 DNA分子 溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收 DNA 分子，完成转化过程。3.重 组 细 胞 导 入 受 体 细 胞 后 ， 筛 选 含 有 基 因 表 达 载 体 受 体 细 胞 的 依 据 是 标 记 基 因是 否 表 达 。第四步：目的基因的检测和表达1.首先要检测 转基因生物的染色体 DNA
10、上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA 分子杂交技术。2.其次还要检测 目的基因是否转录出了 mRNA，方法是采用 用标记的目的基因作探针与 mRNA 杂交。3.最后检测 目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取 蛋白质，用相应的 抗体进行抗原抗体杂交。4.有时还需进行 个体生物学水平的鉴定。如 转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。（三）基因工程的应用1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。2.动物基因工程：提 高 动 物 生 长 速 度 、 改 善 畜 产 品 品 质 、 用 转 基 因 动 物 生 产 药 物。3.基因治疗：把正常的外源基因导入病人体
11、内，使该基因表达产物发挥作用。（四）蛋白质工程的概念蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）转录 翻译专题 2 细胞工程（一）植物细胞工程 1.理论基础（原理）：细胞全能性全能性表达的难易程度：受精卵生殖细胞干细胞体细胞；植物细胞动物细胞2.植物组织培养技术（1）过程：离体的植物器官、组织或细胞 愈伤组织 试管苗 植物体（2）用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。（3）条件：离体、无菌、营养
12、物质、激素、光照等其他适宜条件。（4）地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。植物繁殖微型繁殖：可以高效快速地实现种苗的大量繁殖作物脱毒：采用茎尖组织培养来除去病毒（因为植物分生区附近的病毒极少或没有）人工种子：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经人工薄膜包装得到的种子。优点：完全保持优良品种的遗传特性，不受季节的限制；方便储藏和运输 作物新品种培育单倍体育种：a 过程：植株（AaBb）通过减数分裂得到花粉（ AB、Ab、aB、ab 四种类型） ；对花粉进行花药离体培养（技术是植物组织培养） ，得到单倍体植株；对其幼苗时期进行秋水仙素处理，得到
13、了正常的纯合二倍体植株（AABB、AAbb、aaBB、aabb 四种类型） 。b 优点：明显缩短育种年限，迅速获得纯系植株。突变体利用：在组织培养中会出现突变体，通过从有用的突变体中选育出新品种（如筛选抗病、抗盐、含高蛋白的突变体 ）细胞产物的生产：通过能够产生对人们有利的产物的细胞进行组织培养，从而让它们能够产生大量的细胞产物。（5）地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。3.植物体细胞杂交技术（1）过程：（2）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激等。化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。（3）去壁的方法：酶解法（纤维素酶和果胶酶）（4）意义：克服了
14、远缘杂交不亲和的障碍。（二）动物细胞工程1. 动物细胞培养（1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。（2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）剪碎用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞制成细胞悬液转入培养瓶中进行原代培养贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。（4）动物细胞培
15、养需要满足以下条件无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血浆等天然成分。温度：适宜温度：哺乳动物多是 36.50.5；pH：7.27.4。气体环境：9 5%空 气 5%CO2。 O2是 细 胞 代 谢 所 必 需 的 ， CO2的 主 要 作 用 是 维 持 培养 液 的 pH。（5）动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。2.动物体细胞核移
16、植技术和克隆动物（1）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。（2）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比较大，容易操作；卵(母)细胞细胞质多，营养丰富。（3）体细胞核移植的大致过程是： 高产奶牛（提供体细胞）进行细胞培养；同时采集卵母细胞，在体外培养到减二分裂中期的卵母细胞，去核（显微操作）注：为什么要用卵细胞？它可以提供充足的营养；操作简便；细胞质不会抑制细胞核全能性的表达；将供体细胞注入去核卵母细胞；通过电刺激使两细胞融合，供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎；将胚胎移入受体（代孕）母牛体内；生出与供体奶牛遗传基因相同的犊牛核移植胚胎移植（4）体细胞
17、核移植技术的应用：加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育； 保护濒危物种，增大存活数量；生产珍贵的医用蛋白； 作为异种移植的供体；用于组织器官的移植等。（5）体细胞核移植技术存在的问题：克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。3.动物细胞融合（1）动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。（2）动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。（3）动物细胞融合的意义：克服了远缘杂交的不亲和性，成
18、为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。（4）动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较：细胞工程 植物体细胞杂交 动物细胞融合理论基础 细胞的全能性、细胞膜的流动性 细胞增殖、细胞膜的流动性融合前处理酶解法去除细胞壁（纤维素酶、果胶酶）注射特定抗原，免疫处理正常小鼠诱导手段 物理法:离心、振动、电激化学法：聚乙二醇（PEG）物理法:离心、振动、电激化学法：聚乙二醇生物法：灭活的病毒（灭活的仙台病毒）诱导过程 第一步：原生质体的制备（酶解法）第二步：原生质体融合（物、化法）第三步：杂种细胞的筛选和培养第四步：杂种植株的诱导与鉴定正常小鼠免疫处理动物细胞的融合（物、化、生法）杂交瘤细胞
19、的筛选与培养专一抗体检验阳性细胞培养单克隆抗体的提纯结果 获取杂种植株 获得杂种细胞，以生产细胞产品用途和意义克服远缘杂交的不亲和障碍，大大扩展杂交的亲本组合范围应用：白菜-甘蓝等杂种植株（1）制备单克隆抗体（2）诊断、治疗、预防疾病，例如“生物导弹”治疗癌症4.单克隆抗体（1）抗体：一个 B 淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。（2）单克隆抗体的制备过程：对免疫小鼠注射特定的抗原蛋白（目的使小鼠产生了效应 B 细胞）；提取 B 淋巴细胞；同时用动物细胞培养的方法培养骨髓瘤细胞并提取；促使它们细胞融合注：融合的结果是有很多不符合要求的；如有 2 个 B
20、淋巴细胞融合的细胞等，所以要进行筛选；在特定的选择培养基上筛选出融合的杂种细胞特点是能迅速大量增殖，又能产生专一的抗体；然后对它进行克隆化培养和抗体检测筛选出能够分泌所需抗体的杂种细胞；最后将杂交瘤细胞在体外做大规模培养或注射入小鼠腹腔内增殖，从细胞培养液或小鼠腹水中可得到大量的单克隆抗体。（3）杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。（4）单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。（5）单克隆抗体的作用： 作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。 用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生
21、物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。1. 植物组织培养与动物细胞培养的比较植物组织培养 动物细胞培养原理 细胞的全能性 细胞的增殖培养基的物理性质固体 液体（合成培养基）培养基的成分 水、矿质元素、维生素、蔗糖、氨基酸、琼脂、激素等葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等结果 培育成新的植株或组织 培育成细胞系或细胞株培养目的 植株快速繁殖脱毒植株的培育人工种子生产药物、杀虫剂等转基因植物的培育蛋白质生物制品的生产皮肤移植材料的培育检测有毒物质生理、病理、药理学研究取材 植物幼嫩的部位或花药等 动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织其他条件 均为无菌操作，需要适宜的温度、pH、O 2 等条
22、件3生物技术与育种技术 原理 优点 缺点诱变育种基因突变提高生物便宜的频率，使后代变异性状较快稳定；可大幅度改良某些性状，缩短育种进程盲目性大，需大量处理供试材料杂交育种基因重组使位于不同个体的优良性状集中于一个个体周期长，难以克服远缘杂交不亲和的障碍单倍体育种染色体变异 获得个体均为纯种，明显缩短育种年限技术复杂，须与杂交育种配合、且需细胞工程参与多倍体育种染色体变异 器官大，提高产量和营养成分适用于植物，动物方面难以展开基因工程育种分子遗传学原理打破物种界限，定向地改造生物遗传性状技术要求高细胞工程育种细胞生物学和分子生物学原理、基因突变植物体细胞杂交可以克服远缘杂交不亲和的障碍，扩大了用
23、于杂交的亲本范围；定向改造生物遗传性状远缘杂种不能按人们的需要表现出亲代的优良性状二、克隆技术（细胞工程）（一）克隆1.个体通过无性繁殖可以连续传代并形成群体，这样的群体称为无性繁殖系2.克隆就是指无性繁殖系（名词） ；是通过单个细胞，特别是来自特定个体的单个体细胞进行无性繁殖，从而产生新个体的过程或技术（动词）3.无性生殖概念：不经过两性生殖细胞的结合，由母体直接产生新个体的生殖方式。种类:概念 举例 共同点分裂生殖 由一个生物体直接分裂成为两个新个体。这两个新个体，大小和形状基本相同。草履虫细菌出芽生殖 在母体的一定部位上长出芽体。芽体长大以后从母体上脱落下来，成为与母体一样的新个体。水螅
24、、酵母菌孢子生殖真菌和一些植物，能够产生一种无性的生殖细胞，称孢子。孢子在适宜的环境条件下，能够萌发并长成新植株。根霉、铁线蕨营养生殖 植物体营养器官的一部分，在与母体脱离后，能够发育成为一个新个体。草莓、马铃薯新个体是由母体直接产生出来，新个体所含的遗传物质与母体的相同，因而新个体能够保持母体的一切性状。4.有性生殖.概念：由亲本产生有性生殖细胞，经过两性生殖细胞的结合，成为合子，再由合子发育成新个体的生殖方式。.意义：产生的后代具备了双亲的遗传特性，具有更强的生活力和变异性，对于生物的生存和进化具有重要的意义。5.克隆的理论基础：从理论上说，由于细胞核具有基因组全套遗传信息，生物的体细胞有
25、潜力直接发育成胚胎和形成与核供体完全相同的个体克隆（具有发育的全能性） ，但实际上动物胚胎发育的条件和基因调控机理复杂，动物克隆的实现并非是一件简单的事。6.克隆的条件：细胞（主要是包含遗传物质的细胞核）具有发育全能性是生物克隆的基本条件（严格说是克隆的潜能） 。实际研究表明，生物（特别是高等动物）克隆的基本条件：（1）具有包含物种完整基因组的细胞核的活细胞；（2）能有效调控细胞核发育的细胞质物质；（3）完成胚胎发育的必要的环境条件。4、细胞增殖：无丝分裂 （蛙的红细胞）真核细胞分裂的方式： 有丝分裂 （形成体细胞） 最主要的分裂方式减数分裂 （形成生殖细胞）细胞周期：细胞周期是连续分裂的细胞
26、从前次分裂完成到后次分裂完成所经历的过程，包括两次分裂之间的分裂间期和正在分裂的分裂期。有丝分裂的意义遗传物质的稳定对于生物十分重要，染色体上有遗传物质，必须准确而万无一失地传递给后代！纺锤丝的形成保证了每个染色体分裂后平均分配到两个子细胞中去。从而保证染色体的的遗传物质在亲代与子代细胞之间稳定的传递。专题 3 胚胎工程1精子的形成：（1） 场所：睾丸的曲细精管（示图）（2） 时期：从初性期到生殖机能衰退。在精细胞的变形过程中，细胞发生较大的变化，如下：2卵子的发生：（1）场所：卵巢（2）时间：哺乳动物在出生前（胎儿时期）完成卵泡的形成和在卵巢内的储备，到性成熟时经减数分裂形成卵子。（3）过程
27、：卵子的发生过程大体可以分为两个阶段：第一阶段：初级卵母细胞的形成阶段。第二阶段：初级卵母细胞分裂形成卵子阶段。特别提示：受精作用发生的时间在两处并不矛盾。受精作用是一个过程，减数第二次分裂是在精子和卵子结合的过程中完成的，只有在减数第二次分裂完成后，才能真正完成精子和卵子的核融合过程。是否受精的标志：是否受精的标志是在卵黄膜和透明带的间隙可以观察到两个极体时，说明卵子已经完成了受精。同时说明了第一极体和次级卵母细胞的分裂不是同步的，当完成受精作用时第一极体还没有分裂。种类 项目场所：在自然条件下，受精是在雌性的输卵管内完成的。准备阶段：本阶段又分为准备阶段 1（精子获能阶段）、准备阶段 2（
28、卵子的准备）两个阶段。准备阶段 1：精液由精子和精清（精浆）两部分组成。精清中含有一种能抑制精子获能的物质，因此，在一般情况下，精液中的精子无法获能。只有当交配后精液进入雌性动物的生殖道时，由生殖道分泌产生一种物质解除对精子获能的抑制，才能引起精子获能，精子获能后才能完成受精作用。精子在雌性动物生殖道内获能的部位因种类而异，但主要是子宫和输卵管。准备阶段 2：卵子在受精前也要经历类似精子获能的过程，动物排出的卵子成熟程度不同，有的是次级卵母细胞，有的是初级卵母细胞，它们都要在输卵管内进一步成熟，当达到减数第二次分裂的中期时，才具备与精子受精的能力。受精阶段：(1)顶体反应：获能后的精子，在雌性
29、动物生殖道与卵子相遇时，出现精子顶体膨大，精子质膜（外膜）和顶体外膜局部融合，并在融合处形成一些泡状物，随后脱落，造成精子顶体外膜出现孔洞，使顶体内储存的与受精有关的酶释放出来，参与精子和卵子的受精过程，这种生理现象叫顶体反应。(2)防止多精子入卵受精的两道屏障：屏障：透明带反应。当精子越过放射冠，进入透明带并接触卵黄膜的瞬间，卵子发出指令（信号），产生阻止后续的精子进入透明带的生理反应。屏障：卵黄膜封闭作用。当第一个精子进入卵黄膜后，会立即引起卵黄膜的紧缩、增厚，产生阻止其他精子进入卵内与卵子结合受精的生理反应，也叫做多精子入卵阻滞。(3)精子入卵后发生的变化：尾部脱离，原有的核膜破裂，形成
30、新的核膜，最后形成一个比原来精子核还大的雄原核。(4)卵子入卵后发生的变化：变化：卵黄膜封闭，拒绝其他精子再进入卵内。变化：卵子完成减数第二次分裂，排除第二极体，形成雌原核。(5)雄原核和雌原核彼此接触，并融合为合子，即受精卵。3.胚胎发育早期胚胎发育的过程：注意：（1）卵裂期的特点：细胞进行有丝分裂，细胞数目增加，染色体数目增加，但胚胎总体积不增加，或略有缩小。（2）桑椹胚前的每一个细胞都有发育成完整胚胎的潜能，属于全能性细胞。（3）囊胚时期细胞开始出现分化，内细胞团将来发育成胎儿的各种组织，滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘；出现囊胚腔。（4）原肠腔时期的细胞进一步发育，内细胞团表层细胞形成外
31、胚层，发育成神经系统、感觉器官、表皮及其附属结构。下方的细胞形成内胚层，发育成肝、胰等腺体，以及呼吸道、消化道上皮。滋养层发育成胎膜和胎盘。1.卵母细胞采集的方法和操作的要领对实验动物小鼠、兔和小家畜猪、羊等卵母细胞采集时，可先用促性腺激素处理，使其排出更多的卵子，然后在适当的时间从输卵管冲取卵子，并使其直接与获能的精子在体外受精。第二种方法是从刚屠宰的雌性动物体内摘取卵巢，再从卵巢中采集卵母细胞。还可以直接从活体动物的卵巢中采集卵母细胞，叫活体采卵。需借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜，直接从活的动物卵巢中吸取卵母细胞。后两种方法适用于大家畜和大动物。采集的卵母细胞需在体外培养成熟后才能与获能
32、的精子受精。2.采集精子的方法和具体要求主要方法有假阴道法、手握法和电刺激法。假阴道法是用特制的假阴道，满足雄性动物交配时对压力、温度和润滑度的要求。同时要配备有与供精动物相适应的台畜，训练动物爬跨台畜，借假阴道收集精液。手握法是通过徒手或戴乳胶手套的手，直接把握雄性动物阴茎，施以适当压力和刺激即可引起射精，并可收集富含精子部分的精液。电刺激法是采用特制的电极伸入动物的直肠直接刺激位于腰荐部的射精中枢引起射精，此方法只适用于野生或某些经济动物。此外，对于啮齿类的实验动物可在处死后从附睾尾收集精液。3.试管婴儿技术“试管婴儿”是指分别将卵子与精子取出后，在体外 (培养皿中) 使其受精，并发育成胚
33、胎后，再植回母体子宫内。因此，胚胎在体外培养的时间只有几天，最重要的目的是确定精卵能结合成功，并筛选好的胚胎植回母体，以增加怀孕成功的机会。“试管婴儿”技术主要包括：(1)超排卵 (2)卵泡监测 (3)取卵手术 (4)精卵体外处理 (5)体外受精 (6)胚胎的体外培养 (7)胚胎移植1. 胚胎移植胚胎移植俗称人工授胎或借腹怀胎。它是将动物的受精卵或早期胚胎，从供体移植到同种动物的受体内，使其继续发育的技术。胚胎移植的意义：充分发挥优良母牛的繁殖潜力。诱发肉牛产双胎。应用胚胎移植还可以减少肉用繁殖母牛的饲养头数，可代替种畜的引进和保存品种资源等。胚胎移植的生理基础：发情后的母牛生殖器官的生理变化
34、相同，为胚胎发育提供各种条件的主要生理学依据。早期胚胎的游离状态胚胎在发育早期有相当一段时间(附植之前)是独立存在的，它的发育基本上靠本身贮存的养分，还未和子宫建立实质性联系。胚胎移植不存在免疫问题。受体并不会对胚胎产生遗传上的影响，不会影响胚胎固有的优良性状。胚胎移植的技术程序包括超数排卵、供体母牛的配种、胚胎的收集、胚胎的检查、胚胎的保存和胚胎的移植等技术程序。在胚胎移植中：该过程中两次使用促性腺激素，第一次对受、供体进行同期发情处理；第二次用于供体的超数排卵。该过程中的两次检查：第一次对收集的胚胎进行检查；第二次对受体母牛是否妊娠进行检查。产下的犊牛性状取决于所用公牛和供体牛，性别取决于
35、公牛提供何种类型的精子，二者与受体牛没有关系。冲卵的含义是从子宫中冲出胚胎，而非冲出卵子。2. 胚胎分割移植借助显微操作技术或徒手操作方法切割早期胚胎成二、四等多等份再移植给受体母畜，从而获得同卵双胎或多胎的生物学新技术。来自同一胚胎的后代有相同的遗传物质，因此胚胎分割可看成动物无性繁殖或克隆的方法之一。进行胚胎分割时，应选择发育良好、形态正常的桑椹胚或囊胚，将其移入盛有操作液的培养皿中，然后，用分割针或分割刀进行分割。对于不同发育阶段的胚胎，分割的具体操作不完全相同。具体操作时，用分割针或分割刀将胚胎切开，吸出其中的半个胚胎，注入预先准备好的空透明袋中，或直接将裸半胚胎移植给受体。在对囊胚阶
36、段的胚胎进行分割时，要注意将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。胚胎分割移植是指在囊胚期之后，原肠胚之前对受精卵进行分割，再移植到不同的子宫内，就可发育成多个相同的幼体，主要作用是进行优良品种的快速繁殖。但有一定的风险，目前还有很多不理想的地方。3.干细胞的分类与胚胎干细胞干细胞分为三类：全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞。胚胎干细胞属于全能干细胞。来源于早期胚胎或从原始性腺中分离出来的一类细胞，简称 ES 细胞或 KS 细胞。在功能上，具有发育的全能性，可分化为成年动物体体内任何一种组织细胞。具有胚胎细胞的特性，在形态上表现为细胞小，细胞核大，核仁明显；在体外培养的条件
37、下，可以增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可进行遗传改造。胚胎干细胞的主要用途是：是研究体外细胞分化的理想材料，在饲养层细胞上或在添加抑制因子的培养液中，能维持不分化的状态。在培养液中加入分化诱导因子，如牛黄酸等化学物质时，就可以诱导细胞向不同细胞和组织分化，这为揭示细胞分化和细胞凋亡的机理提供了有效的手段；可以用于治疗人类由于细胞坏死、退化或者功能异常引起的顽症。随着组织工程技术的发展，通过体外诱导分化，定向培育人造组织器官，用于器官移植，解决供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题。（一）动物胚胎发育的基本过程1、胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如胚胎移植、
38、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。经过处理后获得的胚胎，还需移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。2、动物胚胎发育的基本过程（1）受精场所是母体的输卵管上段。（2）卵裂期：特点：细胞有丝分裂，细胞数量不断增加，但胚胎的总体体积并不增加，或略有减小。 （3）桑椹胚：特点：胚胎细胞数目达到 32 个左右时，胚胎形成致密的细胞团，形似桑椹。是全能细胞。（4）囊 胚：特点：细胞开始出现分化（该时期细胞的全能性仍比较高）。聚集在胚胎一端个体较大的细胞称为内细胞团，将来发育成胎儿的各种组织。中间的空腔称为囊胚腔。（5）原肠胚：特点：有了三胚层的分化，具有囊胚腔和原肠腔。（二）胚胎干细胞
39、1、哺乳动物的胚胎干细胞简称 ES 或 EK 细胞，来源于早期胚胎或从原始性腺中分离出来。2、具有胚胎细胞的特性，在形态上表现为体积小，细胞核大，核仁明显；在功能上，具有发育的全能性，可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。另外，在体外培养的条件下，可以增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可进行遗传改造。3、胚胎干细胞的主要用途是：可用于研究哺乳动物个体发生和发育规律；是在体外条件下研究细胞分化的理想材料，在培养液中加入分化诱导因子，如牛黄酸等化学物质时，就可以诱导 ES 细胞向不同类型的组织细胞分化，这为揭示细胞分化和细胞凋亡的机理提供了有效的手段；可以用于治疗人类的某些顽疾，如帕金森综合症、
40、少年糖尿病等；利用可以被诱导分化形成新的组织细胞的特性，移植 ES 细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能；随着组织工程技术的发展，通过 ES 细胞体外诱导分化，定向培育出人造组织器官，用于器官移植，解决供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题。（三）胚胎工程的应用1.体外受精 属 有性 生殖过程 和胚胎的早期培养(1)卵母细胞的采集和培养：主要方法：用促性腺激素处理，使其排出更多的卵子，然后，从输卵管中冲取卵子，直接与获能的精子在体外受精。第二种方法：从刚屠宰母畜的卵巢中采集卵母细胞；第三种方法是借助超声波探测仪、腹腔镜等直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。采集的卵母细胞，都要在体外经
41、人工培养成熟后，才能与获能的精子受精。(2) 精子的采集和获能：在体外受精前，要对精子进行获能处理。对啮齿动物、兔、猪等的精子用培养法（放入人工配制的获能液中） ；对牛、羊等精子用化学法（放在肝素或钙离子载体溶液中）(3) 受精：获 能 的 精 子 和 培 养 成 熟 的 卵 细 胞 在 获 能 溶 液 或 专 用 的 受 精 溶 液 中 完 成受 精 过 程 。(4)胚胎的早期培养：精子与卵子在体外受精后，应将受精卵移入发育培养液中继续培养，以检查受精状况和受精卵的发育能力。培养液成分较复杂，除一些无机盐和有机盐外，还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分，以及血清等物质。当胚胎发育到
42、适宜的阶段时，可将其取出向受体移植或冷冻保存。不同动物胚胎移植的时间不同。(牛、羊一般要培育到桑椹胚或囊胚阶段才能进行移植，小鼠、家兔等实验动物可在更早的阶段移植，人的体外受精胚胎可在 816 个细胞阶段移植。)2.胚胎移植(1)胚胎移植是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及其它方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其它雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。其中提供胚胎的个体称为“供体”，接受胚胎的个体称为“受体”。（供体为优良品种，作为受体的雌性动物应为常见或存量大的品种。）地位：如转基因、核移植，或体外受精等任何一项胚胎工程技术所生产的胚胎，都必须经过胚胎移植技术才能获得
43、后代，是胚胎工程的最后一道“工序”。(2) 胚胎移植的意义：大大缩短了供体本身的繁殖周期，充分发挥雌性优良个体的繁殖能力。(3) 生理学基础：动物发情排卵后，同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的。这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。早期胚胎在一定时间内处于游离状态。这就为胚胎的收集提供了可能。受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应。这为胚胎在受体的存活提供了可能。供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响。(4) 基本程序主要包括：对供、受体的选择和处理。选择遗传特性和生产性能优秀的供体，有健康的体质和正常繁殖能力的受体，供体和
44、受体是同一物种。并用激素进行同期发情处理，用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理。配种或人工授精。对胚胎的收集、检查、培养或保存。配种或输精后第 7 天，用特制的冲卵装置，把供体母牛子宫内的胚胎冲洗出来(也叫冲卵)。对胚胎进行质量检查，此时的胚胎应发育到桑椹或胚囊胚阶段。直接向受体移植或放入196的液氮中保存。对胚胎进行移植。移植后的检查。对受体母牛进行是否妊娠的检查。3.胚胎分割(1)概念：是指采用机械方法将早期胚胎切割 2 等份、4 等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。(2)意义：来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，属于无性繁殖。(3)材料：发育良好，形态正常的桑椹胚或囊胚。（桑椹胚至
45、囊胚的发育过程中，细胞开始分化，但其全能性仍很高，也可用于胚胎分割。）(4)操作过程：对囊胚阶段的胚胎分割时，要将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。说明细胞的分化举例说明细胞的全能性1、细胞分化（1）概念：在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。（2）原因：不同的细胞中遗传信息的执行情况是不同的。（3）特点：普遍性、持久性、稳定性、不可逆性（4）意义：细胞分化是生物个体发育的基础。2、细胞全能性的概念（1）定义：生物体内，已经分化的细胞，仍然具有发育成完整个体的潜能。植物细胞具有全能性；动物细胞核保持全能性。（2）细胞
46、全能性在生产实践中的应用 例：植物组织培养3、干细胞（1）概念：一类可以分化成为各种细胞的未分化细胞。（2）分类（按来源）： 胚胎干细胞、 成体干细胞 （按分化潜能）：全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞（3）特点：进行不对称分裂（4）应用：细胞移植、器官移植专题 4 生物技术的安全性和伦理问题（一）转基因生物的安全性争论 ：(1)基因生物与食物安全：反方观点：反对“实质性等同”、出现滞后效应、出现新的过敏原、营养成分改变正方观点：有安全性评价、科学家负责的态度、无实例无证据(2)转基因生物与生物安全：对生物多样性的影响反方观点：扩散到种植区之外变成野生种类、成为入侵外来物种、重组出有害的病原体
47、、成为超级杂草、有可能造成“基因污染”正方观点：生 命 力 有 限 、 存 在 生 殖 隔 离 、 花 粉 传 播 距 离 有 限 、 花 粉 存 活 时 间 有 限(3)转基因生物与环境安全：对生态系统稳定性的影响反方观点：打破物种界限、二次污染、重组出有害的病原微生物、毒蛋白等可能通过食物链进入人体正方观点：不改变生物原有的分类地位、减少农药使用、保护农田土壤环境（二）生物技术的伦理问题(1)克隆人：两种不同观点，多数人持否定态度。否定的理由：克隆人严重违反了人类伦理道德，是克隆技术的滥用；克隆人冲击了现有的婚姻、家庭和两性关系等传统的伦理道德观念；克隆人是在人为的制造在心理上和社会地位上
48、都不健全的人。肯定的理由：技术性问题可以通过胚胎分级、基因诊断和染色体检查等方法解决。不成熟的技术也只有通过实践才能使之成熟。中国政府的态度：禁止生殖性克隆，不反对治疗性克隆。四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人的实验。(2)试管婴儿：两种目的试管婴儿的区别两种。不同观点，多数人持认可态度。否定的理由：把试管婴儿当作人体零配件工厂，是对生命的不尊重；早期生命也有活下去的权利，抛弃或杀死多余胚胎，无异于“谋杀”。肯定的理由：解决了不育问题，提供骨髓中造血干细胞救治患者最好、最快捷的方法，提供骨髓造血干细胞并不会对试管婴儿造成损伤。(3)基因身份证：否定的理由：个人基因资讯的泄
49、漏造成基因歧视，势必造成遗传学失业大军、造成个人婚姻困难、人际关系疏远等严重后果。肯定的理由：通过基因检测可以及早采取预防措施，适时进行治疗，达到挽救患者生命的目的。（三）生物武器(1)种类：致病菌、病毒、生化毒剂，以及经过基因重组的致病菌。(2)散布方式：吸入、误食、接触带菌物品、被带菌昆虫叮咬等。(3)特点：致病力强、多数具传染性、传染途径多、污染面广、有潜伏期、不易被发现、危害时间长等。(4)禁止生物武器公约及中国政府的态度不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。专题 5 生态工程1生态原理2生态工程实例分析实例 问题 原理 对策 案例农村综合发展型生态工程实现物质的多级循环利用，在资源有限的条件下能较多的产出，以解决人多地少的矛盾物质循环再生原理、整体性原理、物种多样性原理建立综合发展型生态工程窦店村
