1、,作者简介, 胡云建,主任检验师, 北京医院临床微生物室主任 中华检验医学杂志编委、协和医学杂志编委 卫生部实验室病原菌实验室生物安全评审专家等 获卫生部科技进步二等奖一次，北京市科技成果三等奖二次 以第一作者或通讯作者发表文60余篇，参加编写10本专著和2本译著。,难辨梭菌感染检测,北京医院临床微生物室 胡云建,内容, 一、难辨梭菌与抗生素相关性腹泻,1) 难辨梭菌,2) 难辨梭菌感染流行病率3) 难辨梭菌感染途径,4) 难辨梭菌感染关键风险因素,二、难辨梭菌实验室检测方法,三、介绍目前国内唯一毒素检测试剂VIDAS CDAB,一、难辨梭菌与抗生素相关性腹泻,1)2)3)4),难辨梭菌难辨梭
2、菌感染流行病难辨梭菌感染关键风险因素难辨梭菌感染途径,什么是难辨梭菌?,革兰阳性厌氧菌易形成芽孢广泛存在于土壤，和动物肠道产毒性菌株产生毒素自1970年代被确定为腹泻和结肠,炎的致病菌 抗生素相关腹泻病例20%由此病菌引起,难辨梭菌如何致病?,肠道正常菌群被破坏时(如抗生素治疗)，难辨梭菌就,会在肠道内繁殖.然后，细菌会 :,在肠道内增殖,致病株产生两种外毒素, 肠毒素A, 细胞毒素 B,有些仅产生毒素B,损坏肠道细胞内膜, 影响肠神经，,激起免疫反应,导致腹泻和结肠炎.,难辨梭菌感染与临床表现,难辨梭菌感染相关的主要疾病:,伪膜性肠炎(PMC), 95%的PMC是难辨梭菌感染引起的,中毒性巨
3、结肠,结肠穿孔,脓毒血症,死亡罕见,临床表现: 水样 便 (3次 天) 伴:,发热,胃纳差,恶心,腹痛,白细胞增多症,感染性腹泻 腹泻：大便性状改变+频率3次/天 感染性腹泻：病原微生物引起，以腹泻为主要特征的一组肠道传染病，通常伴随恶心、呕吐、或腹痛 按照病生理分为：吸收不良性腹泻，分泌性腹泻，侵袭性腹泻和抗生素相关性腹泻院内感染,性腹泻抗生素相,难辨梭,难辨梭菌感染占到抗生素相关性腹泻的20-30%的病例难辨梭菌感染是医院内感染性腹泻的主要原因,关性腹泻抗生素相关腹泻的主要致病菌为艰难梭菌,菌群,失失调及真菌数量增多可能在AAD发生中起着重,菌感染要作用-胡云建 中国临床药理学杂志 201
4、1年第12期9,难辨梭菌感染难辨梭菌感染的确诊依赖于临床症状和实验室检查，两者缺一不可,临床症状,实验室检查,便检 难辨梭菌毒素或者产毒素检测 阳性腹泻或者 肠镜/组织病理学检查证实伪膜性肠炎临床实践中，抗 生 素 使 用一般是诊断依据的一部分，但也存在极少量（60岁老年人血培养基、中国蓝培养基、SS培养基、真菌显色培养基，CCFA培养基和PY培养基诊断：优势菌或肠镜见假膜或CD毒素（EIA+PCR）186 例腹泻中,C.diff+C.per:1,胡云建. 中国药理学报2011; 27：977,发热、水样泻和低蛋白血症在CDI病人中显著C.diff: 35;19%多见 (pICU 普内科 /
5、外科病房,其它,难辨梭菌的传染方式, 医院内的交叉感染, 粪口传播,医疗工作者手部被污染,医院内环境物品表面被污染, 宿主:,细菌感染人类,感染环境,难辨梭菌芽孢能在环境中存活长达5个月,18,19,收治入院,抗生素使用,细菌获得,无症状定植,有症状感染,难辨梭菌感染: 获得与发病,Riggs et al, clin infect dis 2007;45;992-820,难辨梭菌对环境的污染其他部位皮肤腹股沟皮肤胸腹部皮肤,其他环境表面呼叫按钮床把手病房桌子电话,难辨梭菌感染患者难辨梭菌感染患者,无症状难辨梭菌定植无症状难辨梭菌定植,无难辨梭菌定植无难辨梭菌定植,共用医疗仪器，如听诊器、超声探
6、头等，会传播病原体, 有文章指出，超过50%的座便器都被检测到难辨梭菌,有文章研究了3年内由MRSA、VRE和CD引起的院感比例,发现MRSA下降21%，VRE下降41%，但CD的比例没有改变,在流行暴发时，使用酒精消毒液进行手卫生对难辨梭菌无效,多次提及难辨梭菌,J Hosp Infect (2007) 65S, S1S64,小结 难辨梭菌-条件致病菌，革兰阳性，厌氧菌，形成芽孢，存活时间长 难辨梭菌感染的危害主要包括两方面, -病人,腹泻为主的临床症状和相关疾病，, -公共卫生危害：院内交叉感染和CDAB爆发流行 预防 预防腹泻 首要预防 = 合理的抗生素处方 较少某些抗生素处方以降低难辨
7、梭菌感染发生 预防交叉感染 难辨梭菌感染的精确诊断 注意接触 地区/群体隔离 (症状结束后72h解除） 注意戴手套 加强手卫生 酒精消毒剂无效 只有机械性消毒是有效的 难辨梭菌感染流行时，脱去手套后，用肥皂和流水洗手, 保持环境清洁,22,二、难辨梭菌检测, 难辨梭菌检测具有显著的临床价值:, 难辨梭菌流行病学调查 治疗, 感染预防和控制, 诊断性检测应用的重点在, 病人入选,难辨梭菌检测方法,检测方法毒素检测毒素酶免疫法(EIA),优势快速，简单，便宜,劣势敏感性不够，但对于难辨梭菌感染具有很高特异性,细胞培养+细胞毒性试,比毒素酶免疫方法更敏感，劳动密集型; 需要特殊设备，24-48小,验
8、细菌检测谷氨酸脱氢酶(GDH) EIA核酸扩增检测(PCR)粪便培养,生物活性毒素快速，敏感快速，敏感，检测毒素基因的存在操作合适的情况下是最敏感的方法,时得出最终检测结果特异性较差，需要进一步测试来确定诊断，不是100%敏感。费用高，需要特殊设备，可能过于敏感确认毒素产生，劳力密集型，需要48-96小时出结果,诊断文献解读的误区, 临床数据的缺乏, 难辨梭菌的检测，不等同于难辨梭菌感染的诊断, 无症状的细菌定植比感染更普遍, 难辨梭菌细菌检测的敏感度提高，可能降低了难辨,梭菌感染的特异度,Peterson, CID. 2007,敏感性提升降低了检测的特异性, 即便是按照临床金标准临,床显著的
9、腹泻:, 对敏感性没有影响, 核酸扩增PCR检测的特异性,下降，从98% 到 89% (p 0.01), 阳性预测值下降至60%的水,平(下降25%), 一项魁北克的研究, 仅有PCR阳性的病人很少具有,难辨梭菌感染相关临床并发症, 3% vs. 39%; p0.001,Dubberke. JCM. 2011; Longtin. Clin Infect Disease. 2012,自动重复检测：糟糕实践, 重复测试会导致检出,发病率下降,阳性预测值下降,(PPV), 频繁的重复测试可能,错误地将难辨梭菌感,染发病率提高26%,Peterson. Ann Intern Med . 2009. 1
10、51:176-9; Litvin M. Infect Control Hosp Epidemiol. 2009. 30: 1166-71,难辨梭菌的诊断模式, 在控制成本的同时提高检测的敏感度, 问题：没有任何一个检测是100%敏感的, 组合诊断方法的敏感度=,检测方法1的敏感度 X 检测方法2的敏感度,任何组合方法的敏感度比其中任一方法的敏感度都要低,最近发表的检测方法比较文献,研究文献EastwoodNovak-Weekley,检测工具Remel XpectPremier ImmunocardTechlab toxin A/B IIVidas C.difficile toxin A/BPr
11、emier Toxin A/BTechlab GDHBD GeneOhm C. difficilePremier Toxin A/BCephied Xpert C. difficileGDH + PremierGDH + Xpert,敏感度68.8%68.8%80.0%80%80.8%87.6%88.5%58.3%94.4%55.6%86.1%,特异度99.4%93.0%96.0%97.3%97.5%94.3%95.4%94.7%96.3%98.3%97.8%,+ Cytotoxin 83.1% 96.7%,组Novak-,GDH + PremierGDH=87.6%, PCR=88.5%,E
12、astwood. J Clin Microbiol. 2009; 47:3211-17;合方法=77.5%Weekley. J Clin Microbiol. 2010. e-pub ahead of press,最佳检测方法：尚无定论, 敏感度差的检测：假,阴性问题, 特异度差的检测:假阳,性问题, 组合检测, 患者人群, 检测目的 可用设备、资源,检测目的,假阴性的影响,假阳性的影响,治疗, 导致未治疗的难辨梭菌感,染, 没必要的针对难辨梭菌感,染的治疗 错诊腹泻的,真实原因 检测方法应该个体化：,感染预防,与控制,的传染扩散,导致难辨梭菌 没有必要的,接触隔离 医疗资源错配, ESCMI
13、D 欧洲难辨梭菌研究组,案= 养+,最佳诊断方案=培养+毒素检测（或产毒培养）,Clin Microbiol Infect. 2003 Oct;9(10),欧洲指南,欧洲指南,三、难辨梭菌的检测方法与,VIDAS毒素检测产品,33,目前欧洲难辨梭菌检测方法调查结果,34,87.7%的医院进行常规的难辨梭菌检测,93%的医院使用毒素检测方法， 其中79%用酶免疫方法EIA，17.3%,用细胞毒性试验,难辨梭菌毒素A/B检测,国内唯一的免疫学毒素检测,Mixthe,stools,成形或,半成形粪便,Add 1000 l R1,3,Mix,Vortex4,Stool(200mg),Gauged2 T
14、ubeR1水样便,H2O,200l,Centrifugation,5,12000g,Mixthe,200l,CDAB 试剂和标本准备 遵循的步骤:,stools2StatSpinExpress 2,Specificity (%),CDAB敏感性&特异性,90,10098969492,50,60,70,80,90,Sensitivity(%),Premier ToxinA&BGA ClostridiumdifficileAgRidascreentoxinA&BTechlabToxinA/BIIRemelProSpecTVidas CDifficileToxinA&BRemelXpect,Tech
15、labToxinA/BQuikChekPremier ImmunicardA+B,Cytotoxin,Figure 2: Sensitivity, specificity were calculated for eachtest in comparison with the gold standard cytotoxin assay (n = 596)Kerrie Eastwood1, Patrick Else1, Andr Charlett 2 and Mark Wilcox; Comparison of C. difficile detection methods. J. Clin. Mi
16、crobiol.doi:10.1128/JCM.01082-09 26 August 2009,CDAB 表现,UK national External Quality Assessment Service,假阴性在同类产品中最低,CDAB 表现,US CAP survey,假阳性在同类产品中最低,难辨梭菌检测的病人送检标准,40,“抗生素后腹泻，,考虑难辨梭菌”,标本采集, (1).粪便样本 采用干净防漏容器收集腹泻患者的粪便，水,样便或稀便是理想标本。不添加任何防腐剂。, (2).肛拭子 只有在极少情况下，如患者出现肠梗阻而无腹,泻的时候，肛拭纸才作为病原菌培养的送检标本。, (3).也可接受肠内容物和手术或尸检的大肠标本。,CDAB 保存条件 样本保存: 新鲜采集的粪便标本 (水样或固体). 避免重复的冰冻和解冻过程, 常温下2-3小时毒素会降解,3 天2 8C,样本准备前,样本准备后,2 天2 8C样本处理,或,然后,1 月-256C,1 月-70C,或更冷样本采集Liquid or solid,2013ECCMID新趋势,中,南,大,学,湘,雅,医,学,院,.,
