1、第9章 临床常见病原体检测Chapter 9 Pathogen Detection tests,Department Laboratory MedicineProf. Zhengjun Y,教学目的与要求：Objective Requirement,1 掌握临床病原体检查的相关流程（标本采集、标本验收、药敏检查、耐药性检测、临床常见病原体、病毒性肝炎、性传播疾病、医院感染）2 了解其检测原理3 掌握其临床意义和应用,提 纲 (Outline),Section 1：标本的采集运送、实验室评价和检查方法Section 2：病原体耐药性检测Section 3：临床感染常见病原体检测Section 4
2、：病毒性肝炎检测Section 5：性传播疾病病原体检测Section 6：医院感染常见病原体检测,基本原则1：正确的标本类型和采集部位以反映有效病程2：采集和运送应无菌操作，避免污染3：尽快送检4：视所有标本为传染品，高度污染标本要有明显标识5：注意生物安全，标本用后要做消毒处理,一、标本采集和运送,（一）血液标本的采集,适应症：疑似菌血症、败血症或脓毒血症的病人酒精棉球消毒，防止污染。静脉采血后，将血液注入培养瓶内 。采集时间：一般在抗生素使用前，于发热初期或高峰期采血。采集频率：24小时内采血23次可提高阳性率，且在不同部位。采血量：血液与培养基的比例为1：5-10，一般成人血量510m
3、l，婴儿1-5ml。,（二）尿液标本的采集,首次晨尿，无菌采集中段尿10-20ml。排尿困难者考虑导尿采集标本。如考虑厌氧菌感染，采取膀胱穿刺法采集标本。,（三）粪便标本采集,自然排便者：挑取脓、血或粘液部分于清洁容器中送检。排便困难者：采用直肠拭子采集。怀疑霍乱弧菌感染引起的腹泻，立即接种或将标本置于碱性蛋白胨水或卡-布运送培养液送检。传染性腹泻应连续送检3次。,（四）呼吸道标本采集,类型：鼻咽拭、痰和经气管采集的标本。采集时间：晨痰，且在取痰前用清水反复漱口。方法：（1）自然咳痰法：（2）气管镜下采集法；（3）气管穿刺法。WBC 25/lp,上皮10/lp。上呼吸道存在正常菌群，在采集标本
4、与结果分析时应予考虑。,（五）脑脊液与其它无菌体液采集,临床医生采用腰椎穿刺，抽取2-3ml，置于无菌容器中立即送检，不得保存于冰箱中。脑膜炎的主要病原体：脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌。,（七）泌尿生殖道标本采集,性传播性疾病取尿道口分泌物、外阴糜烂面病灶边缘分泌物、阴道宫颈口分泌物和前列腺液等。 生殖道疱疹常穿刺抽取疱疹液。盆腔脓肿患者则于直肠子宫凹陷处穿刺取脓液。所有标本收集后于4保存直至培养,（八）创伤、组织和脓肿标本,损伤范畴较大的创伤，从不同部位采集多份标本，清除污物，以碘酒、酒精消毒皮肤。开放性脓肿：无菌棉拭子采集脓液及病灶深部分泌物。封闭性脓肿：无菌干燥注射器抽取。疑为
5、厌氧菌感染，取脓液后立即排净注射器内空气，针头插入无菌橡皮塞送检。,二、标本的实验室质量评估标准,1标本必须注明姓名、年龄、性别、采集日期、临床诊断、检验项目等基本信自。 2仔细核对标本采集日期和送检日期。延误的标本，一般情况下不接收。通常用于细菌学检验的标本的存放不要超过24h。而病毒检测的标本可于4存放23天。 3检查送检容器是否完整，有无破损或渗漏等情况，若有则不予接收。 4标本储存、运送方式不当，不予接收。 5明显被污染的标本不予接收。6标本量明显不足的标本，不予接收。 7同一天申请做同一实验的重复送检标本(血培养除外)，不予接收。 8对于烈性传染病标本的采集和运送应严格执行相关规定，
6、要有完善的防护措施，按规定包裹及冷藏，附有详细的采样及送检纪录，由专人护送。,三、检查方法,（一）直接显微镜检查（二）病原体特异性抗原检查（三）病原体核酸检查（四）病原体的分离培养和鉴定（五）血清学试验,（一）直接显微镜检查,染色标本目的：了解细菌的形态、染色性或观察宿主细胞内包涵体。方法：革兰染色、墨汁染色、抗酸染色、荧光染色,革兰染色,细菌的形态、染色性的特征,意义,1. 无菌体液的直接镜检对病原体诊断具有重要意义。2. 分离培养为阴性时的镜检往往在诊断中起关键作用。3. 荧光显微镜用于标本经荧光染色后直接检出某些病原微生物4. 电镜检查不常规用于临床，对某些病毒感染却有确诊的价值。,(二
7、)病原体特异性抗原检查,利用抗原抗体之间的特异性反应，用已知抗体检测患者血清及其他体液中的待测抗原，借助免疫荧光技术、酶联免疫技术、化学发光技术、胶乳凝集试验、对流免疫电泳等技术检测标本中未知的病原体抗原，其诊断价值常以标本不同而各异。 标本中如果存在多种正常寄居微生物，可因交叉抗原存在而不能肯定诊断。检测细菌不同的抗原构造，还可分析细菌的菌群和血清型，如沙门菌属、志贺菌属和霍乱菌属等,细菌的血清分型：O1群霍乱弧菌的菌体抗原由A、B、C三个抗原成份组成,利用抗原抗体之间的特异性反应，用已知抗体检测患者血清及其他体液中的待测抗原,检测细菌不同的抗原构造，还可分析细菌的菌群和血清型，如沙门菌属、
8、志贺菌属和霍乱菌属,（三）病原体核酸的检测,常用试验方法有：PCR。polymerase chain reaction聚合酶链式反应，简称PCR技术。核酸探针杂交技术Realtime PCR基因芯片等,基因组DNA,获取特定DNA片段,扩增特定DNA片段,PCR扩增产物电泳,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,（三）病原体核酸的检测Realtime PCR,实时荧光定量PCR：通过起始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现核酸定量的一种技术。广泛应用于结核和麻风分枝杆菌、乙型肝炎病毒、丙型和戊型肝炎病毒、HIV、巨细胞病毒的检查,意义,灵敏度高，是检测病原体微生物最
9、灵敏的方法，但具有一定的假阳性与假阴性。特异性强，阳性只表明存在某种病原体的核酸，是否正被感染应结合临床具体分析。特别适用于目前尚不能分离培养或很难分离培养的微生物。适用于核酸变异的病原微生物，如病毒,（四）病原体的分离培养和鉴定,明确感染病原体提供体外抗微生物药物敏感试验结果,细菌分离培养与鉴定的结果评价：,正常人群的无菌体液中检测到细菌，应考虑细菌为感染的病原体。存在正常菌群的标本检测到细菌，应结合细菌的量考虑是否为致病菌。如临床表现支持感染，但培养阴性，应考虑为标本不合格、培养不恰当等因素。直接镜检找到病原体，而培养阴性，应考虑有L细菌、厌氧菌或苛氧菌感染。 不能人工培养的病原体感染性疾
10、病：将标本接种易感动物、鸡胚或行细胞培养,（五）血清学试验,用已知病原体的抗原检测患者血清中相应抗体以诊断感染性疾病。,人体感染病原体后经过一定时间产生特异性抗体，在体内可维持数月或更长时间。,适用范围,血清学诊断可用于现症诊断，还可以用于疾病追溯调查。血清学诊断对于某些病原体不能培养或难以培养的疾病，可以提供诊断的依据，,提 纲 (Outline),Section 1：标本的采集运送、实验室评价和检查方法Section 2：病原体耐药性检测Section 3：临床感染常见病原体检测Section 4：病毒性肝炎检测Section 5：性传播疾病病原体检测Section 6：医院感染常见病原体
11、检测,第二节：病原体耐药性检测,抗菌药物是目前临床使用最为广泛的药物，它的发现、研制和临床应用是现代医学史上的重要里程碑，使绝大多数微生物感染，尤其是细菌感染成为可治性疾病,抗生素压力,体外抗菌药物敏感试验的方法,常用的检查细菌是否对药物耐药的方法有定性测定的纸片扩散法、定量测定的稀释法和E试验法。对某些特定耐药菌株的检测除药物敏感试验外还要附加特殊的酶检测试验、基因检测等方法。常用方法有:纸片扩散法（Kirby-Bauer test）稀释法（dilution test）E试验法（E test） 耐药筛选试验折点敏感试验,药敏试验结果的解释（1）,敏感（susceptible）：表示测试菌能被
12、测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭。耐药（resistant）：表示测试菌不能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭，治疗无效。,药敏试验结果的解释（2）,中介 (intermediate) : 测试菌能被测定药物大剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制，或在测定药物浓集部位的体液(如尿)中被抑制该范围作为敏感与耐药之间的缓冲区，避免由于微小技术误差影响实验结果。,（二）特殊的耐药菌监测的特殊试验,由于细菌存在一种或几种耐药机制，造成了细菌的多重耐药性。单一的药敏试验已不能完全表示细菌的耐药性，必须进行一些特殊的耐药性监测试验。1.耐甲氧西林葡萄球菌（MRS
13、）的筛选测定2.氨基糖苷类抗生素高耐药肠球菌的筛选测定3.耐万古霉素肠球菌（VRE）的筛选测定4.耐青霉素肺炎链球菌（PRSP）的筛选测定5.-内酰胺酶的检测6.超广谱-内酰胺酶（ESBL）的检测,1.耐甲氧西林葡萄球菌的筛选测定（methecillin resistance staphylococcus，MRS）,包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌是目前导致医院感染的重要病原菌。此类葡萄球菌具有多重耐药性，即对全部一内酰胺类抗菌药物，包括青霉素族和头孢菌素族以及临床常用的其他多种抗菌药物均耐药。因此，此类葡萄球菌的早期检出和确定具有重要临床意义,1.耐甲氧西林葡萄球菌
14、的筛选测定（methecillin resistance staphylococcus，MRS）,1g苯唑西林纸片的抑菌圈直径10mm，或MIC4g/ml的金黄色葡萄球菌, 1g苯唑西林纸片的抑菌圈直径17mm，或MIC0.5g/ml的凝固酶阴性葡萄球菌称耐甲氧西林葡萄球菌。,临床意义,对所有-内酰胺类药物均无效，并对氨基糖甙类、大环内脂类、克林霉素和四环素等抗生素多重耐药。治疗首选药物为万古霉素。,2.超广谱-内酰胺酶(extend spectum -lactamase, ESBL)的检测,超广谱-内酰胺酶是由质粒介导的基因所编码，可水解青霉素类、头孢菌素和氨曲南，主要见于大肠埃希菌、肺炎克
15、雷伯克、产酸雷伯菌及奇异变形杆菌。筛选方法：双纸片扩散法、三相试验和E试验双纸片协同试验操作简便、结果可靠、成本不高，是临床上较常开展的项目。,临床意义,产ESBL细菌，不论体外药物敏感试验结果如何， 对青霉素类、1-3代头孢菌素类和氨曲南治疗均无效，药敏也全部修改成耐药。,提 纲 (Outline),Section 1：标本的采集运送、实验室评价和检查方法Section 2：病原体耐药性检测Section 3：临床感染常见病原体检测Section 4：病毒性肝炎检测Section 5：性传播疾病病原体检测Section 6：医院感染常见病原体检测,（一）细菌感染检查项目的选择,细菌感染性疾病
16、一般均需进行细菌学诊断以明确病因。三个方面着手：检测细菌或其抗原-主要包括直接涂片显微镜检查、培养、抗原检测与分析。检测抗体。检测细菌遗传物质-主要包括基因探针技术和PCR技术。 难培养或培养要求高的细菌：综合运用免疫学或分子生物学检测，如结核分枝杆菌感染以及幽门螺杆菌感染等。细菌培养是最重要的确诊方法。,（二）病毒感染检查项目的选择,在易感细胞内以复制方式进行增殖的非细胞型微生物病毒感染的实验室检查包括病毒分离与鉴定、病毒核酸与抗原的直接检出，以及特异性抗体的检测。 病毒分离与鉴定：细胞培养。早期诊断手段：多检测病毒抗原、特异性抗体或核酸。,（三）真菌感染检查项目的选择与应用评价,真菌是以腐
17、生或寄生方式摄取养料的真核细胞型微生物。真菌的微生物学诊断手段主要包括直接检查、培养检查、免疫学试验和动物试验,直接显微镜检查：初步明确真菌感染,分离培养：明确何种真菌感染,大多数真菌营养要求不高，常用沙保氏培养基 （SDA）培养。浅部病原性真菌的最适温度为2228，生长缓慢，大多于14周出现典型菌落。深部病原性真菌培养在37中生长最好，生长较快，经3-4天即长出菌落。,（四）寄生虫感染检查项目的选择与应用评价,直接显微镜检查：观察寄生虫生活史的各阶段，是寄生虫感染的主要诊断依据。寄生虫抗体检测：辅助诊断。,（五）其他：立克次体检测,专性细胞内生长的原核细胞性微生物对多种抗生素敏感引起自然疫源
18、性疾病，且为人畜共患,病原体 所致疾病立克次体属 斑疹伤寒（流行性斑疹伤寒、地方性斑疹伤寒、 加拿大斑疹伤寒） 斑点热（洛矶山斑点热、纽扣热、昆士兰热、 立克次体痘、北亚蜱传斑疹伤寒）柯克斯体属 Q热东方体属 恙虫病群（恙虫病）埃立克体属 犬埃立克体群（人单核细胞埃立克体病） 腺热埃立克体群（腺热埃立克体） 嗜吞噬细胞埃立克体群（人粒细胞埃立克体病）巴通体属 战壕热、猫抓病、Oroya热、秘鲁疣、杆菌性血管瘤、 心内膜炎,外斐试验为非特异性血清学诊断试验，用于斑疹伤寒、斑点热和恙虫病的确诊特异性血清学试验有免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验和补体结合试验等,提 纲 (Outline),Sectio
19、n 1：标本的采集运送、实验室评价和检查方法Section 2：病原体耐药性检测Section 3：临床感染常见病原体检测Section 4：病毒性肝炎检测Section 5：性传播疾病病原体检测Section 6：医院感染常见病原体检测,病毒性肝炎主要有7型，即甲型(HA)、乙型(HB)、丙型(HC)、丁型(HD)、戊型(HE)、庚型(HG)、输血传播病毒肝炎它们分别由肝炎病毒甲型(HAV)、乙型(HBV)、丙型(HCV)、丁型(HDV)和戊型(HEV)、庚型(HGV)、输血传播病毒(TTV)所引起。,乙型肝炎病毒标志物检测,乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）为嗜肝D
20、NA病毒，属于包膜病毒。在电镜下可见大球形颗粒、小球形颗粒和管型颗粒,大球形颗粒,小球形颗粒,管形颗粒,乙型肝炎病毒血清标志物的综合评价,(1) (2) (3) (4) (5) 急性或慢性乙型肝炎，高传染性 急性、慢性乙型肝炎或慢性HBsAg携带者 急性乙肝趋向恢复或慢性乙肝，弱传染性 急性HBV感染康复期或有既往感染史，有免疫力 乙肝恢复期，弱传染性 急性HBV感染“窗口期”， 或既往曾感染过乙肝 接种HBV疫苗或HBV感染后康复 急性乙肝康复期，开始产生免疫力 无HBV感染,HBV DNA：是HBV感染最直接，最灵敏和最特异的检测指标，且血清中HBV DNA的水平可作为治疗方案与疗效观察的
21、指标。,HBV DNA定量检测,提 纲 (Outline),Section 1：标本的采集运送、实验室评价和检查方法Section 2：病原体耐药性检测Section 3：临床感染常见病原体检测Section 4：病毒性肝炎检测Section 5：性传播疾病病原体检测Section 6：医院感染常见病原体检测,1.性传播性疾病（sexually transmitted disease,STD）：是指通过各种性接触而传播的侵犯皮肤、性器官及全身多脏器的疾病，简称性病（venereal disease）2.分类：（1）经典（传统）STD：梅毒、淋病、软下疳和性病性淋巴肉芽肿。（2）目前：全球发现的
22、STD有30余种，常见为17种；（3）我国法定为8种： 梅毒、淋病、尖锐湿疣、软下疳、性病性淋巴肉牙肿、非淋病性尿道炎、生殖器疱疹及艾滋病。,（一）流行病学,（二）常见临床类型,性病 病原体艾滋病 人类免疫缺陷病毒梅毒 梅毒螺旋体淋病 淋球菌非淋球菌尿道炎 溶脲支原体、沙眼衣原体等生殖器疱疹 单纯疱疹病毒尖锐湿疣 人乳头瘤病毒软下疳 杜克雷嗜血杆菌,重要的性病及病原体,（1）艾滋病病原体测定,直接显微镜检查与分离培养：病毒培养是检测HIV感染最精确的方法，一般采取培养外周血单个核细胞的方法进行HIV的诊断。临床较少采用。ELISA等为过筛实验，此法敏感性高，但容易出现假阳性结果，故阳性者需用其
23、他试剂盒重复1次 。HIV-RNA检测：通常是通过检测HIV RNA水平来反映病毒载量，直接反映病情进展，病毒核酸检测方法可用于HIV的早期诊断。排除假阳性可确诊。Western blot：通常作为检测抗HIV一1和抗HIV一2的确诊实验，该法敏感性和特异性皆好 。,（2）淋病病原体的检测方法,涂片检查：多形核白细胞内见革兰氏阴性双球菌，男性泌尿生殖道标本可明确诊断，而女性需结合培养结果分析。,提 纲 (Outline),Section 1：标本的采集运送、实验室评价和检查方法Section 2：病原体耐药性检测Section 3：临床感染常见病原体检测Section 4：病毒性肝炎检测Sec
24、tion 5：性传播疾病病原体检测Section 6：医院感染常见病原体检测,医院感染(nosocomial infection),医院感染又称院内感染或医院获得性感染。是病人、探视者或陪诊者、医院职工在医院里受到感染并出现症状者。内源性感染（自身感染）寄居在体内的正常菌群或条件致病菌，在病人免疫功能低下时引起的感染外源性感染（交叉感染）是指病人与病人、病人与医务人员以及病人与探视者之间的直接感染，或通过空气、水、医疗器械、手等的间接感染。,医院感染常见的病原体,细菌为主要病原体。细菌的种类因时、地和人而异。不同临床类型其感染细菌的构成比不同。,第10章 其他检测Chapter 10 Othe
25、r Clinical Assays,Department Laboratory MedicineProf. Zhengjun Y,提 纲 (Outline),Section 1：基因诊断(Molecular Diagnosis)Section 2：（自学）流式细胞术(Flow cytometry,FCM)及其临床应用Section 3：染色体(Chromosome)检查,第一节 基因诊断,一、基因诊断的含义 基因诊断在基因水平上对疾病或 人体的状态进行诊断。它是以遗传物质（DNA RNA)为检查对象，利用分子生物学技术通过检查基因的结构或表达量的多少来诊断疾病的方法。这里的遗传物质即可以是外源
26、性致病基因，如病毒、细菌等，也可以是内源性基因。,d.NTPs,耐热DNA聚合酶,引物,退火,加入试管中,PCR反应原理和反应过程,第二个循环4个拷贝,第三个循环8个拷贝,第n个循环2n个拷贝,基因诊断在临床医学中的应用,1.遗传性疾病的基因诊断2.感染性疾病的基因诊断3.肿瘤的基因诊断4.在法医学中的应用5.cDNA文库的建立6.特定基因的筛选等。,第三节 染色体检查一、染色体检查的方法二、染色体异常及染色体病三、XYY综合症染色体检查四、白血病的染色体检查,BCR-ABL融合基因,PML-RAR,应用 DNA染色体分析 三体分析 染色体作图 分裂间期研究 产前诊断 CGH,MetaphaseChromosom 1, FITCChromosom 12, TRITCChromosom 17, FITC and TRITC,NucleoliChromosom 13q14, FITCChromosom 21, TRITC,24 色荧光原位杂交或 M-FISH,分裂中期,核型,临床应用,出生缺陷干预工程唐氏综合征地中海贫血神经管缺损苯丙酮尿症G6PDSNPs感染性疾病的鉴别诊断药物敏感性亲子鉴定,肿瘤的分子病理学血液病乳癌肝癌胃癌肺癌膀胱癌结肠癌,DNA,RNA,Thanks for your attention!,
