1、血栓与止血的检验(Laboratory Diagnosis of Thrombosis and Hemostasis),南方医科大学第一临床医学院 实验诊断学教研室 李强,广东省精品课程: 实验诊断学 ( ),一、基础理论,（1）止血机制（血管壁、血小板）（2）凝血系统和抗凝机制（3）纤溶系统,止血机制,一、血管的止血功能 (Hemostastic function of blood vessel wall),.神经反射,管腔收缩,血流变慢,出血/停止,.内皮细胞分泌vWF、Fn、PAF,促进plt粘附、聚集,.释放FIII,启动外源性凝血途径,.暴露内皮下胶原,促进血小板粘附启动内源性凝血途
2、径,二、血小板的止血作用( Hemostatic function of platelets) 维持血管壁的完整性，毛细血管的通透性 粘附、聚集在血管破损处，形成白色血栓 释放活性物质，促进血小板聚集，增强血管收缩 促进凝血过程 血块收缩，形成稳固血栓,三、凝血因素(Blood coagulation) 激活内、外源凝血途径， 形成纤维蛋白网 止血血栓（红色血栓）,凝血机制(Mechanism of coagulation),一、 凝血因子( Coagulation factors)：目前公认的凝血因子共14个，按罗马字命名的有 12个，尚有高分子量激肽原(HMWK)，激肽释放酶原(PK)除因
3、子IV（Ca2+）外，其他均为蛋白质；除因子III（组织因子，TF）外，其他均存在血浆中大多数由肝脏产生，其中II、VII、IX、X合成依赖于Vitk，称Vitk依赖因子正常情况下，所有因子都处于无活性状态,二、凝血过程(Coagulation pathway)： 第一阶段 凝血酶原酶生成 内源性凝血途径 外源性凝血途径 第二阶段 凝血酶生成 第三阶段 纤维蛋白生成,内源性凝血途径( intrinsic),外源性凝血途径(extrinsic),正常抗凝机制( Mechanism of anticoagulation),血液中存在多种抗凝物质及抗凝系统 1抗凝血酶（antithrombin ，A
4、T） 占体内总抗凝功能的50-67% AT 灭活IIa、IXa、Xa、a、 XIIa 、激肽释放酶,肝素,抗凝血酶(AT) 抗凝机制,2. 组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor TFPI),3. 蛋白C系统,蛋白C（Protein C, PC）蛋白S（Protein S, PS)血栓调节素（thrombomodulin, TM）活化蛋白C抑制物(activated protein C inhibitor, APCI ),蛋白C系统抗凝机制,主要作用：分解纤维蛋白（原），清除血管内由于纤维蛋白沉积引起的阻塞，保持血流通畅,XIIa PK,纤溶酶原,纤
5、溶酶,u-PA t-PA,-,PAI,-,2- AP,纤溶系统（fibrinolysis）,纤维蛋白生成和降解,非交叉连接纤维蛋白,交叉连接纤维蛋白,纤溶酶,纤溶酶,FPA,FPB,凝血酶,因子XIIIa,纤维蛋白原,纤溶酶,二、检验项目,（1）血管壁的检验（2）血小板的检验（3）凝血功能检验（4）抗凝物质检查（5）纤溶功能检查,血管壁的检验,一、毛细血管抵抗力试验（capillary resistance test, CRT），毛细血管脆性试验，束臂试验原理：对毛细血管施加压力，观察血管壁、血管 内皮细胞、 血小板综合止血作用参考值：5cm直径圆圈内，男性5个出血点， 女性及儿童10个出血点
6、临床意义：抵抗力减弱：血管病变；血小板减少； 血小板功能异常；血管性血友病,筛检试验,CRT (capillary resistance test),二、出血时间（Bleeding Time，BT）测定原理：皮肤毛细血管刺破，出血自然停止所需的时间。 主要受血小板数量和功能影响， 其次受血管壁完整性和收缩功能影响， 凝血因子影响较小参考值：标准化出血时间测定器法（template bleeding time,TBT) 6.92.1min, 超过9min为异常,标准化出血时间测定器法测定BT,临床意义： 延长见于：1 血小板明显减少：原发或继发性血小板减少性紫癜2 血小板功能异常： 血小板无力症
7、；3 严重缺乏血浆有关因子： vW病、DIC；4 血管异常：遗传性出血性毛细血管扩张症；5 药物影响： 乙酰水杨酸,血管性血友病因子抗原测定（vWF：Ag）血管性血友病因子活性测定（vWF：Ag）血浆凝血酶调节蛋白抗原测定（TM：Ag）血浆内皮素-1测定(ET-1)血浆 6-酮-前列腺素 F1测定 （PGI2的降解产物）,诊断试验,诊断试验,血管性血友病因子抗原测定（vWF：Ag）血管性血友病因子活性测定（vWF：A）,血小板检测,一、血小板计数(platelet count,PC)参考值： （100-300）109/L检测方法： 显微镜计数 血细胞分析仪,筛检试验,1 减少：100109/L
8、（1）生成障碍：再障、放射线损伤、白血病、骨髓纤维化等（2）破坏或消耗增加： a 免疫破坏：血小板自身抗体、过敏性药物损伤 b 消耗亢进：DIC； c 血小板自身异常：先天性血小板减少症2 增加：400109/L（1）原发增多：慢粒、真红细胞增多症、原发血小板增多症（2）反应性增多：急慢性炎症、缺铁性贫血、肿瘤,临床意义：,二、血块收缩试验（clot retraction test，CRT）原理：血液凝固后，血小板释放血栓退缩蛋白，使纤维蛋白网退缩，挤出血清。 与血小板质、量，纤维蛋白原的质、量，其他凝血因子的质、量，纤溶功能有关,血清析出,血小板功能纤维蛋白原数量血浆异常蛋白,影响因素,CR
9、T (clot retraction test),参考值：血块收缩率=析出血清量/全血量（100%-Hct%） 100% 参考值：65.8 11.0%临床意义： 退缩率下降见于 1 血小板减少：Plt50 109/L ； 2 血小板功能异常：血小板无力症； 3 严重凝血因子异常：VIII 缺乏； 4 纤维蛋白原或凝血酶原显著降低,血小板相关免疫球蛋白血小板粘附试验血小板聚集试验血小板激活的分子标志物 1、-血小板球蛋白（ -TG） 血小板第4因子（PF4）测定 2、P-选择素 3、血浆血栓烷B2（TXB2）测定,诊断试验,（一）血小板相关免疫球蛋白测定 （platelet associated
10、 immunoglobulin, PAIg） PAIgG、PAIgM和PAIgA ELISA法测定 PAIg增高，见于ITP、同种免疫性血小板减少性紫 癫及药物免疫性血小板减少性紫癫等。,（二）血小板粘附试验,计算： 临床意义：见于血管性血友病，巨PLT综合征，BM增生，抑制剂使用见于高凝状态，血栓病,（platelet adhesion test, PAdT）,粘附前PLT-粘附后PLT,粘附率=,粘附前PLT,诊断试,（三）血小板聚集试验,原理： 诱聚剂 PRP PAgT 临床意义：见于血小板无力症，尿毒症，BM增生，plt抑制剂使用见于高凝状态，血栓病,透光度,ADP，肾上腺素，凝血酶，
11、胶原，花生四烯酸，瑞斯托霉素,（platelet aggregation test, PAgT）,Tests of thrombus and haemostasis,诊断试验,（四） 血小板激活的分子标志物 1、-血小板球蛋白（ -TG） 血小板第4因子（PF4）测定 2、P-选择素(P- selectin, GMP-140) 3、血浆血栓烷B2（TXB2）测定,凝血功能检测,1.外源性凝血途径的综合检查 血浆凝血酶原时间（Prothrombin Time, PT）2.内源性凝血途径的综合检查 活化部分凝血活酶时间（Activated Partial Thromboplastin Time,
12、APTT）,筛检试验,Sysmex CA7000,PT 原理,in Blood,in Plasma,PT Reagent,Fibrin,Extrinsic System,Measure Clotting Time,without,Tissue Factor,Calcium (Ca2+),without,without,Normal Range11-13 sec,37癈,Ca2+, PL,Ca2+, PL,BloodSampling,TrisodiumCitrate,一、PT实验结果报告形式 PT时间：11-13s，超过 3s为异常 PT比值（PTR）：10.05 国际标准化比值（INR）：PT
13、RISI，10.1二、临床意义：PT延长 外源及共同途径凝血因子异常 先天性或获得性（DIC、Vit K缺乏，肝病等）PT缩短 高凝状态、多发性骨髓瘤等,三、PT试验的临床应用 口服抗凝剂的监测（INR最好在2.0-3.0） 肝疾患严重程度的分类维生素K缺乏DIC诊断标准 外源性途径出血筛选 手术前常规检查,APTT原理,in Blood,in Plasma,without,without,without,APTT Reagent,Activator,PL,Intrinsic System,Measure Clotting Time,Ellagic acid, silica etc.,Calc
14、ium (Ca2+),Normal Range32-43 sec,CaCl2,Phospholipid,Fibrin,37癈,Ca2+, PL,Ca2+, PL,BloodSampling,TrisodiumCitrate,一、APTT试剂组成 磷脂：经氯仿或乙醚浸提的组织凝血活酶 接触因子激活物：白陶土、鞣花酸等二、参考值 32-43s，延长10秒以上为异常,三、临床意义 APTT延长 内源性及共同通路凝血因子缺乏 1 先天性凝血因子异常：甲、乙型血友病等 2 后天性多种凝血因子缺乏：严重肝病、 DIC 等 3 循环抗凝物增加：SLE APTT缩短 DIC、妊高征等高凝状态,四、APTT测定
15、的临床应用* 肝素治疗的监测的理想实验 APTT比(1.5-2.5)* 血友病的筛选：血友病甲、乙，APTT明显延长* DIC的诊断* 内源凝血因子异常的筛选* 血栓倾向的诊断* 手术前常规(代替凝血时间)* 抗凝物质的检测,纤维蛋白原浓度测定（Fbg)凝血因子VIII、IX、XI、XII活性测定凝血因子II、V、VII、X活性测定凝血因子XIII定性试验凝血酶生成分子标志物,诊断试验,Fbg 测定原理(Clauss Method),in Blood,in Plasma,without,without,without,Fbg Reagent,Fibrin,MeasurementClotting
16、 Time,Thrombin,Normal Range200-400 mg/dL,Calculated forFibrinogen concentration,37,BloodSampling,TrisodiumCitrate,纤维蛋白原测定的临床应用,1 FIB参考值：2 - 4 g/L2 纤维蛋白原含量增高 判定血栓前状态或血栓性疾病的必查项目， 常见疾病如脑血栓形成、心肌梗塞、结核、风湿病、肺炎、恶性肿瘤等3 纤维蛋白原含量减少 a/肝脏疾病：慢性肝炎、肝硬化。 b/DIC诊断的重要筛选实验 c/溶栓治疗的监测 d/原发性纤维蛋白原缺乏症、原发性纤溶活性亢进、 恶性贫血及肺、甲状腺、子宫
17、、前列腺手术等,凝血因子活性检测,血浆因子VIII、IX、XI、XII活性测定原理：受检血浆分别加入乏因子VIII、IX、XI、XII因子的基质血浆，白陶土脑磷脂悬液和Ca2+，测APTT FVIII:C:103%25.7%, FIX:C:98.1%30.4% FXI:C:100%18.4%, FXII:C:92.420.7%减低见于： FVIII:C：血友病甲（重型1%, 中型25%，轻型625%，亚临床型 2645%）；血管性血友病；VIII因子抗体、DIC FIX:C: 血友病乙；肝病、维生素K缺乏、DIC、口服抗凝剂 FXI:C: 因子XI缺乏、肝病、DIC FXII:C：先天性XII
18、因子缺乏症、肝病、DIC 、某些血栓疾病,血浆因子、活性测定原理：受检血浆分别与乏因子II、V、VII、X因子的基质血浆混合，再加兔脑粉浸出液和Ca2+，测PT FII:C:97.7%16.7%, FV:C:102.4%30.9% FVII:C:103%17.3%, FX:C:103%19.0%II:C 、V:C 、 VII:C 、 X:C 主要用于肝脏受损检查;VII:C 下降:肝病早期发生； V:C 在肝损伤、肝移植中应用较多,XIII因子定性试验 方法：纤维蛋白凝块置于5mol/L尿素溶液中 参考值：24h内纤维蛋白凝块不溶解 意义：XIII因子缺陷的筛查试验 24h内，尤其是2h内溶解
19、，提示XIII因子缺乏 见于：先天性XIII因子缺乏症 肝病；SLE；DIC、原发性纤溶症； 转移性肝癌；恶性淋巴瘤,凝血酶生成分子标志物检测 F1+2（凝血酶原片段1+2） FPA （纤维蛋白肽A） SFMC（可溶性纤维蛋白单体复合物） TAT （凝血酶-抗凝血酶复合物）,凝血酶生成分子标志物检测原理,F 1+2：反映凝血酶生成总量及凝血酶原酶活性 凝血酶原 凝血酶 F1+2FPA：代表凝血酶生成后对纤维蛋白原水解能力 纤维蛋白原 非连接性纤维蛋白单体 FPA、FPBSMFC：反映凝血酶作用后纤维蛋白单体的形成TAT：反映凝血酶被抗凝血酶中和的程度,抗凝物质的检查,凝血酶时间（thrombi
20、n time, TT) 抗凝血酶III活性和抗原测定 蛋白C抗原、游离蛋白S测定 组织因子途径抑制物测定 肝素定量 狼疮抗凝物质,纤溶功能的检查,D-Dimer测定纤维蛋白（原）降解产物 (FDP)血浆硫酸鱼精蛋白副凝固试验（3P试验）优球蛋白溶解时间t-PA活性测定PLG活性测定PAI-1活性测定2-PI:A活性测定PAP测定纤维蛋白肽B1-42和B15-42,正常值 阴性(乳胶凝集法) 0-256g/L（ELISA法）,？什麽是继发性纤溶 和原发性纤溶,D-D阴性是排除深静脉血栓（DVT）和肺血栓栓塞（PE）的重要试验,参考值 小于5mg/L,？ 什麽是FDP,FDP阳性或增高见于,原发性
21、纤溶、DIC、血栓形成及溶栓等。,结果判断 阴性,也是鉴别继发性纤溶与原发性纤溶的试验,阳性见于DIC的早、中期，假阳性见于恶性肿瘤、大出血、败血症、创伤、大手术等。阴性见于正常人、晚期DIC和原发性纤溶症。,3P（plasma protamine paracoagulation test）,三、检验项目的选择和应用,一期止血缺陷的筛选试验二期止血缺陷的筛选试验 DIC的实验诊断抗凝与溶栓治疗的监测,1）皮肤、粘膜出血为主，内脏出血少见2）创口即刻出血难止，持续时间不长3）压迫止血有效，止血后不易复发4）有遗传性和获得性,1一期止血缺陷特征:指血管壁和血小板的缺陷,过敏性紫癜发病机制：变态反应
22、 血管通透性或脆性增加 皮肤、粘膜出血临床表现：单纯紫癜型、关节型、腹型、肾型、混合型,实验室检查：1、血小板计数 正常2、出血时间 正常3、束臂试验 部分异常4、凝血时间 正常5、血小板功能试验 正常 6、尿常规检查 肾型或混合型可有 血尿、蛋白尿、管型尿,特发性血小板紫癜idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP,实验室检查1、血小板计数 急性型20mg/L或D-Dimer 增高4倍4.PT延长或缩短3秒以上，APTT延长或缩短10秒以上5.AT-III活性80ng/L或TM较正常增高2倍以上 疑难或特殊病例应有下列2项异常：1.F1+2、TAT、FP
23、A增高 3.PAP增高2.SFMC增高 4. TF增高或TFPI下降,普通肝素：APTT 首选，控制在正常对照值的 1.5-2.5倍药物浓度维持 0.2-0.5 IU/ml体外循环和透析时，用全血凝固时间（ACT）维持 AT 活性在 80-120% 为宜LMWH：较大剂量(2500-10000IU)需监测抗因子Xa活性测定，维持在0.14-0.18单位/ml 二者均需监测血小板,抗凝和溶栓治疗监测,口服抗凝剂的监测PTR 维持在1.5-2.0INR WHO推荐使用 ，中国人维持在2.0-3.0,溶栓治疗监测1 提示溶栓治疗有效的指标D-D 明显上升FDP 明显上升(300mg/L)2-AP30
24、%Fbg 1.2-1.5g/LTT正常对照值的 1.5-2.5倍,2 提示会发生出血的指标,Fbg1.0g/LPLT 50x109/LAPTT正常值的2.5倍以上,1 血友病最主要的发病机制的检查是 A. 出血时间 B. APTT C.血块退缩试验 D.凝血酶原时间测定 E.凝血酶时间测定,思考题,2 出血时间延长见于下列哪些疾病 A. 血小板减少性紫癜.B. 血友病C. 血管性血友病.D. 过敏性紫癜E. 血小板无力症.,参考书目,1、血栓与止血的检测及应用.王学锋，王鸿利主编. 上海：世界图书出版公司.2002.2、血栓与出血的诊断及治疗.李家增，王鸿利，王兆钺，等主编.上海：上海科技教育出版社，2003.,THANK YOU !,
