1、1实验一 酸奶的制作与乳酸菌的活菌计数（5 学时）实验目的：1、学习并掌握酸奶制作的基本原理与方法。2、了解市售酸奶的生产工艺。3、掌握乳酸菌活菌计数方法与操作。实验原理：乳酸菌在乳中生长繁殖，发酵分解乳糖产生乳酸等有机酸，导致乳的 pH 值下降，使乳酪蛋白在其等电点附近发生凝集。乳酸菌属于兼性厌氧微生物，在无氧条件下生长繁殖较好，实验室条件下利用混菌培养的方法，尽可能让乳酸菌在无氧条件下生长，每个单菌落代表一个微生物细胞。实验内容：（一）酸奶制作1、10%脱脂奶粉溶解于热水（80 左右）中，充分搅拌均匀，配成调制乳；2、添加蔗糖：为了缓和酸奶的酸味，改善酸奶口味，在调制乳中加人 4-8的蔗糖
2、。3、灭菌：方法有两种：将乳加热至 90，保温 5min；4、接种：往冷却到 43-45灭过菌的乳中加入乳酸菌，接种量为 2%-5%。5、分装：酸奶受到振动，乳凝状态易被破坏，因此，不能在发酵罐容器中先发酵然后再进行分装，须是将含有乳酸菌的牛乳培养基先分装到小容器中，加盖后送入恒温室培养，在小容器中发酵制成酸奶。6、发酵：发酵的温度保持在 40-43 ，一般发酵时间为 3-6h。发酵终点的确定有两种方法：1）检测发酵奶的酸度，达到 65-70 T。2）倾斜观察，瓶内酸奶流动性差，而且瓶中部有细微颗粒出现。7、冷却：发酵结束，将酸奶从发酵室取出，用冷风迅速将其冷印到 10以下，一般 2 h，使酸
3、奶中的乳酸菌停止生长，防止酸奶酸度过高而影响口感。8、冷藏和后熟：经冷却处理的酸奶，贮藏在 2-5的冷藏室中保存。9、感官指标1）色泽：色泽均匀一致，呈乳白色，或稍带微黄色。2）组织状态：凝块稠密结实均匀细腻，无气泡，允许少量乳清析出。3）气味：具有清香纯净的乳酸味，无酒精发酵味，无霉味和其他外来不良气味。（二）乳酸菌活菌检测、检测培养基：蛋白胨 15g，牛肉膏 5g，葡萄糖 20g，氯化钠 5g，碳酸钙10g，琼脂粉 20g，水 1000ml，115 121灭菌 20min，灭菌后放置水浴52保温备用。 2、稀释：取 10 克样品放入添加 90ml 无菌水的带 4-6 颗玻璃珠的 250ml
4、 三角瓶中，摇床 180rpm 震荡 30min，即为 101 样品溶液；再从中取 1ml 至添加9.0ml 无菌生理盐水三角瓶中，稀释至 102 ，以此类推稀释至 108 ，即稀释了 1 亿倍;、倒培养平板，从上述已稀释了 1 亿倍的乳酸菌悬液中取 1ml，在无菌操作台上注入 9.0cm 培养皿中，再将已经灭了菌的保持在 52水浴锅中的呈溶解状态的培养基，倒入 15 毫升左右于培养皿中，全部浸到培养皿，与菌悬液充分混合均匀（倒入培养基后，马上用手转动培养皿，转动几下，让其混合均匀），然后等其凝固再移入培养箱中培养，注意最后一步倒平皿必须在超净台无菌操作，以免杂菌污染。每次稀释均要换灭好菌的移
5、液管。、培养条件：37恒温培养箱培养 4872h。、培养完毕后，取出进行计数，因为是稀释了 1 亿倍，所以一个透明圈菌落代表 1亿/克，如果有 200 个透明圈，则是 200 亿/ 克。实验器材及试剂：菌种：市售酸奶 试剂：白糖 奶粉 培养基各成分器材：培养箱、电炉、铝锅 5L，培养皿，酸奶发酵瓶（自带） 实验结果：1、 详细描述自己制作的酸奶结果：答：制作后酸奶与市场所售酸奶比较，比市场所售酸奶更稠密，酸奶的香味与酸味明显，制作成功2、 记录个人酸奶中各菌数测定的平行数据，计算最终平均值。答：最终培养基上未出现乳酸菌菌落，全部为杂菌菌落，因此无法统计酸奶中的菌含量3、 同时用图片记录实验过程
6、中各现象与结果并对图进行注释。答：制备乳酸菌时，瓶子上方留有一部分空间，并未使乳酸菌完全处于无氧环境中发酵，但乳酸菌是兼性厌氧菌，因此在存在少量氧气的环境中，乳酸菌也可以生长，酸奶制备成功。但在平板接种时，由于污染杂菌，乳酸菌并未长出。乳酸菌计数失败。思考题：乳酸菌的保藏通常为低温条件，这给运输、保藏带来很大的成本，请问可采用什么方法使乳酸菌在常温条件下有很高的存活率？答：在基因水平上对乳酸菌进行基因重组，从而获得耐高温乳酸菌。在基因库里筛选抗高温的基因并利用基因重组技术将其重组在乳酸菌基3因上，对乳酸菌的基因进行修饰使其表达，以此来获得耐高温菌株。实验二 枯草芽孢杆菌固态发酵及活菌数测定（5
7、 学时）实验目的：1、学习了解固态发酵原理；2、以枯草芽孢杆菌为对象，了解固态发酵的控制技术；3、掌握枯草芽孢杆菌活菌计数方法与操作。实验原理：作为抗生素的替代品，益生菌和酶制剂等的研究与开发近几年成为绿色饲料添加剂的热点，其中益生菌倍受关注。作为益生菌的一种，芽孢杆菌制剂在动物生产中的研究和应用一直都是畜牧业科研和生产人员关注的焦点。目前芽孢杆菌多采用液体深层发酵技术，再经喷雾干燥进行生产，对设备要求高，生产工艺复杂；而固体发酵采用的原料一般是廉价的农副产品( 如草粉、麸皮等) ，采用的设备也较液体发酵简单，生产成本大大低于液体发酵。所以近年来各生产厂家都在积极探索芽孢杆菌的固体发酵技术，以
8、求简化生产工艺，提高产量，降低生产成本。固态发酵定义：指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水不溶性固态基质中，培养一种或多种微生物的生物反应过程，是以气相为连续相的生物反应过程。枯草芽孢杆菌属于好氧微生物，实验室条件下利用稀释涂布培养的方法，让菌在有氧条件下生长，每个单菌落代表一个微生物细胞。实验内容：1、液体种子培养基配制：葡萄糖 0.2%，NaCl 0.5% ，酵母膏 0.5%，蛋白胨 1%，pH 7.0。2、液体种子培养：每 300 mL 三角瓶装量 50 mL 液体种子培养基，在 115条件下灭菌 30 min。降温后从斜面接一环菌苔至种子培养基。置 37控温摇床培养。转速 2
9、00 rmin-1，至芽孢率达 90%以上时停止，约需 24 h。3、固体发酵培养基：麸皮 60%，稻草粉 10%，玉米粉 5%，豆粕 25%，硫酸镁0.05%，硫酸铵 0.5%，料水比为 1:1.1。4、三角瓶固体发酵培养：每 250 mL 三角瓶装量 20-30 g（湿重） ，固体发酵培养基原料试剂混合料，加水，料水比为 1:1.1，搅拌均匀，培养基经 121灭菌 30 min，降温后接种量为2%(V/M： V液体菌种体积数， M固体发酵培养基的质量) ，然后置 37培养箱中静止培养，间时拍打，使其均匀生长。至脱落芽孢率为 80%以上时，停止发酵，约需48 h。4（二）枯草芽孢菌活菌检测、
10、检测培养基：葡萄糖 0.2%， NaCl 0.5%，酵母膏 0.5%，蛋白胨 1%，琼脂粉2%，pH 7.0。115灭菌 20min，灭菌后放置水浴 52保温备用。 、稀释：取 10 克样品放入添加 90ml 无菌水的带玻璃珠的 250ml 三角瓶中，摇床 180rpm 震荡 30min，即为 101 样品溶液；再从中取 1ml 至添加 9.0ml 无菌生理盐水的三角瓶中，稀释至 102 ，以此类推稀释至 108 ，即稀释了 1亿倍;、倒培养平板，将已经灭了菌的保持在 52水浴锅中的呈溶解状态的培养基，倒入 15 毫升左右于培养皿中，全部浸到培养皿，待培养基凝固；从上述已稀释了1 亿倍的菌悬液
11、中取 0.2ml 于已凝固的培养基表面，用玻璃刮铲涂布均匀，静止10min，然后再移入培养箱中培养。、培养条件：37恒温培养箱培养 2448h；、培养完毕后，取出进行计数。（三）芽孢率测定:采用芽孢革兰氏染色后显微镜下观察实验器材及试剂：菌种：枯草芽孢杆菌 试剂：培养基成分 器材：培养箱、灭菌锅，培养皿实验结果：1、 详细描述枯草芽孢杆菌固态培养物（外观、气味、培养物状态等）：答：枯草芽孢杆菌淡黄色，中间色深，表面较平整，无光泽，边缘不整齐，形成的菌落为圆形。培养基中的枯草芽孢杆菌有腥臭味，长势良好，观察培养基，无明显染菌现象。2、 记录活菌测定中各平行数据，计算最终平均值。答：数量 稀释倍数
12、 密度（/g）第一个平板 112 5107 5.6109第二个平板 65 5107 3.25109第三个平板 22 5107 1.1109平均值 3.321093、同时用图片记录实验过程中各现象与结果，并对图进行注释。5菌落成白色，菌落表面有褶皱思考题：在枯草芽孢杆菌固态生产过程中，为了防止霉菌与酵母的污染，可如何进行操作？答：加入抗真菌抑制剂实验三、 淀粉糖化与酒精发酵（5 学时）实验类型：综合性实验目的：1了解酒精发酵的主要类型、工艺原理及其控制条件2熟悉酒精生产的工艺流程、掌握酒精发酵的操作方法 3. 掌握用酶法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法4. 掌握在实验室中模拟酒精发酵的工艺流程
13、实验原理玉米粉、大米粉中可供发酵的物质主要是淀粉，而酿酒酵母由于缺乏相应的酶，所以不能直接利用淀粉进行酒精发酵，因此必须对原料进行预处理，包括蒸煮（液化）、糖化等，蒸煮可使淀粉糊化，并破坏细胞，形成均一的醪液，能更好的接受糖化酶的作用，并转化为可发酵性糖，以便酵母进行酒精发酵。在无氧条件下酵母菌利用可发酵性糖转化为酒精和二氧化碳的作用，称为酒精发酵，是生产酒精及各种酒类的基础，可通过测定发酵过程中产生 CO2 的量和最终产物酒精的量得知酵母的发酵能力。实验内容1、原料的粉碎将玉米、大米用粉碎机粉碎，玉米淀粉含量为 70%，大米淀粉含量为 75%。2、蒸煮糊化 称取一定量的粉碎后淀粉质原料，按一
14、定的料水比（100g：200ml） ，调制淀粉乳，90-100条件下恒温水浴加热，淀粉乳受热后，在一定温度范围，淀粉粒开始破坏，晶体结构消失，体积膨大，粘度急剧上升，呈粘稠的糊状，即成为非结晶性的淀粉。3、糖化 经蒸煮糊化后的醪液，经过淀粉酶的糖化作用，将原料中的淀粉转化为可发酵性糖，供酵母利用。酶参考用量：淀粉乳 33%，60， ph4.5，酶 240U/g 绝干淀粉，糖化时间 16h。糊化醪液调整 pH4.5，往其中加入一定量的淀粉酶（120U/g） 、糖化酶（120U/g） ，60恒温下不断搅拌，直至粘度下降到一定程度，淀粉完全糖化4、发酵6（1）干酵母活化 将干酵母按 1:20 的比例
15、投放于 37的温水中复水20min。目的：恢复酵母细胞的正常功能。（2）淀粉醪液糖化后，取 400ml 上清液于洁净的大可乐瓶中，加相同体积的水稀释，加入活化好的酵母种液 5ml，混匀， 28 度培养箱中静止培养 36h 左右。5、二氧化碳生成的检验（1）观察三角瓶中的发酵液有无气泡溢出； （2）滴入 10%氢氧化钠 1ml 于发酵液试管中，观察，如气体逐渐消失，则说明有二氧化碳的存在；6、二氧化碳生产量的测定 （1）接种完，擦干瓶外壁，于天平上称量，记为 W1;（2）实验结束，取出瓶轻轻摇动，使二氧化碳尽量溢出，在同一天平上称量，记为W2； （ 3）二氧化碳生成量 = W1-W27、酒精生成
16、的检验（1）打开瓶塞，嗅闻有无酒精气味；（2）取发酵液 5ml，加 10%硫酸 2ml；（3）再加入 1% K2Cr2O7 溶液 10-20 滴，如颜色由黄色变为黄绿色说明有酒精产生。K2Cr2O7+H2SO4+CH3CH2OHCH3COOH+K2SO4+Cr2（SO 4） 3实验器材及试剂：菌种：活性干酵母 试剂：培养基各成分、大米粉、活性干酵母、淀粉酶、糖化酶、大可乐瓶 溶液：10% H2SO4 、1%K2Cr2O7、10%NaOH器材：试管、培养箱、灭菌锅、三角瓶、水浴锅、粉碎机、离心机实验结果：1、 详细记录实验过程中各参数及数据。淀粉 淀粉酶 CaCl2 糖化酶100g 10g 0.
17、17g 2.5g2.对实验结果的判断与分析。答:1 二氧化碳生成的检验培养约 48h 后，观察瓶中混合液，淀粉大部分沉降在瓶底，上清浓度较稀，靠瓶壁边缘有一连串微小气泡2 酒精生成的检验打开瓶塞，闻到有浓重酒精气味。取发酵液 5ml, 加 10%硫酸 2ml,加 1%K2Cr2O7溶液 10-20 滴，颜色由黄色变为黄绿色，稍加热后现象产生更快，更明显。思考题：现有 3 株不同来源的酒精酵母，请设计与本实验操作不同的实验，判断哪株7酵母发酵酒精能力最强？答：按实验步骤配制等量的三组醪液，加入等量糖化酶进行糖化作用，将原料中的淀粉转化为可发酵性糖，向三组糖化后的淀粉上清中加入等量 3 株不同来源
18、的酒精酵母种液，相同条件下培养一段时间，分别测定三组实验产生的 CO2 的质量，进行比较。产 CO2 越多表示发酵酒精能力越强。实验四 黑曲霉固体发酵生产纤维素酶及酶解底物反应（5 学时）实验目的：1、了解黑曲霉固体发酵产酶情况2、掌握微生物固体发酵操作技术3、了解纤维素酶提取方法及酶活性定性测定方法实验原理：纤维素酶是降解纤维素的一组酶的总称，是起协同作用的多组分酶系，属于诱导酶，其产生需要纤维素类物质的诱导。实验中以米曲霉为发酵菌株，稻草作为产酶诱导物。实验内容1、黑曲霉菌种活化（1）配制 PDA 培养基：称取 200g 马铃薯，洗净去皮切碎，加水 1000ml 煮沸半个小时，纱布过滤，再
19、加 20g 葡萄糖和 20g 琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约 5-10ml（视试管大小而定） ，15 磅蒸气（121）灭菌 20 分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。（2）在无菌超净台上接种保藏的黑曲霉于 PDA 斜面，28培养 5-7 天，斜面上长满孢子。2、配制发酵培养基：15g 麸皮+10g 稻草粉，0.5%KH2PO4，0.5% (NH4)2SO4 ，加15ml 水（加水量 40%60%） ，拌匀，装瓶；3、灭菌：121 灭菌 30min，冷却至室温。 4、黑曲霉孢子悬浮液制备已培养好的黑曲霉孢子斜面一支，加入约 10ml 无菌水，洗下孢子，制成孢子悬液。5、接
20、种：用移液管在无菌条件下吸取一定量的悬液，移入灭菌好的固体培养基中，于 30 度条件下培养 96h，期间每隔 12h 摇动三角瓶一次。6、提取粗酶液向瓶中加入无菌水约 50ml，浸泡固体曲 30min-1h；过滤得粗酶液。 7、酶活性测定（1）配制 1%CMC 底物平板：配方：1g 羧甲基纤维素钠，1.8g 琼脂， 100ml，琼脂完全溶解后，加入 0.03g 曲8利本蓝，倒平板，每皿约 15ml。（2）打孔：打孔器经酒精燃烧灭菌后，每平板打 4 孔，并在酒精灯火焰上稍稍加热打孔处，使孔周围的培养基微融，然后平放冷却。 （3）加样：往孔内加入粗酶液适量（约 100ul） ，同时需设对照。 （4
21、）培养（反应）：将加样后的平板小心平端放入 30培养箱，放置 20 小时左右。 （5）观察结果：可直接观察透明圈有无、测定透明圈直径。实验器材及试剂：菌种：黑曲霉试剂：土豆、稻草、麸皮、硫酸铵、羧甲基纤维素钠（CMC）器材：培养箱、灭菌锅、三角瓶、摇床、离心机、天平、三角瓶实验结果：1、 仔细观察固体培养基发酵前后的状态，并描述；答：固体培养基发酵前：培养基颜色较浅，各成分（麸皮、稻草）新鲜，粘度大成团状固体培养基发酵后：培养基中产生较多黑色孢子及菌体，培养基营养成分被利用，体积缩小2、 仔细观察底物平板酶解前后的现象，并测量水解圈大小。现象：纸片周围出现浅浅的水解圈，打孔培养基未出现水解圈，
22、纸片直径 2.5cm，水解圈 3cm，直径比 5:6思考题：纤维素是自然界最丰富的资源，从理论角度分析如何最大限度地通过酶法利用该资源？而现实存在什么问题？目前对纤维素降解有哪些研究进展？答：要想最大限度的利用纤维素，可从两个方面入手。一是通过生产高性能纤维素酶的方法，二是找到蕴含能量较高的纤维素。而现实中存在的问题是高性能纤维素酶的获取，而可以通过诱变和筛选获得可产生纤维素酶的新菌株。目前在纤维素的降解方面，微生物的研究较多，降解纤维素的真菌有很多，如木霉属、青霉属、曲霉属、根霉属、漆斑霉属、枝顶孢霉属、毛壳霉属和脉孢霉属等。其中，很多纤维素降解真菌在生长过程中能产生菌丝， 菌丝具有很强的穿
23、透能力，能穿透植物角质层的阻碍，紧紧依附9和穿插在纤维物质上， 增大降解酶与纤维物质的接触面积，从而加快降解速率。如木霉属、青霉属、漆斑霉属、毛壳霉属和脉抱霉属为丝状真菌。目前，木霉属是迄今所知纤维素酶系最全面和研究较多的一个属。实验五 甘露聚糖酶液体发酵及酶解反应（6 学时）实验目的：1. 了解并掌握液体发酵产酶操作及酶反应条件的控制2. 与固体发酵产酶进行比较分析实验原理甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分，其主链是由吡喃甘露糖残基以 1,4-D 糖苷键连接而成。当主链的某些残基被葡萄糖取代，或半乳糖通过 1,6-糖苷键与甘露糖残基相连形成分枝，则称之为异甘露聚糖，主要有半乳甘露聚糖、葡萄甘露
24、聚糖和半乳葡萄甘露聚糖。甘露聚糖是半纤维素的第二大组分，在自然界中分布广泛，且多以异甘露聚糖的形式存在，同型甘露聚糖十分少见。-甘露聚糖酶以内切方式降解甘露聚糖主链产生不同聚合度的甘露寡糖和少量甘露糖，是甘露聚糖降解酶中最关键的酶。甘露聚糖酶可广泛应用于食品、造纸、纺织印染等行业。利用 -甘露聚糖酶可以制取有特殊保健作用的甘露寡糖。在纸浆制造业，可用于代替碱法进行脱色、漂白。在纺织印染方面，利用 -甘露聚糖酶与其它酶联合作用，能有效去除产品上粘附的多余染料，降低能耗和对环境的污染等。甘露聚糖酶的工业化生产将在许多行业产生很大的经济和社会效益。因此，近年来甘露聚糖酶逐渐成为国内外关注和研究的热点
25、之一。甘露聚糖酶是一种半纤维素酶，其产生需要一定的诱导物存在。本实验以枯草芽孢杆菌为菌株，以魔芋粉为诱导物。实验内容1. 菌种活化（1） 配制 LB 固体培养基： 蛋白胨 10g/L， 酵母提取物 5g/L，氯化钠 10g/L，琼脂 20g/L，待琼脂 充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约 5-10ml（视试管大小而定） ，15 磅蒸气（121）灭菌 20 分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。（2）在无菌超净台上接种保藏的枯草芽孢杆菌于 LB 斜面，28培养 2 天。2. 配制产酶培养基：蛋白胨 10g/L， 酵母提取物 5g/L，氯化钠 10g/L，魔芋粉 30g/L，3. 以
26、10%的体积量分装于三角瓶中（25ml 液体培养基/250ml 三角瓶） ，12110灭菌 20 分钟；4. 菌悬液的制备已培养好的枯草杆菌斜面一支，加入约 10ml 无菌水，洗下菌体，制成菌悬液。 5. 接种用移液管在无菌条件下吸取一定量的悬液，移入灭菌好的固体培养基中，于 37度 200rpm 条件下培养 72h。6. 粗酶液提取：3000rpm 离心收集得到粗酶液7. 酶解底物分析：准备两三角瓶，分别加入 50ml 自来水，46 度水浴保温8. 往两三角瓶中各加入 1g 魔芋粉，然后其中一个加入粗酶液 1ml，另一个加入 1ml 蒸馏水（做空白对照） 。以后每隔 5-10min 往两三角
27、瓶中各加入 1g 魔芋粉，前后共加 5g9. 酶解反应 30-60min，期间观察反应现象。实验器材及试剂：菌种：枯草芽孢杆菌 试剂：蛋白胨、酵母粉、氯化钠、魔芋粉器材：培养箱、灭菌锅、三角瓶、摇床、离心机、天平、三角瓶实验结果：1、 仔细观察液体培养基发酵前后的状态，并描述；答：发酵之前的液体培养基的状态：在配制产酶培养基时，魔芋粉难溶解，依旧是固体颗粒。等完全灭完菌后，放正在实验台上，等冷却后，状态比较像固体培养基，但魔芋粉依旧不溶解，其颗粒均匀地分布于培养基中。经过三天的培养之后，产酶培养基被液化，得到的是含有粗酶液的液体培养基，完全呈黄褐色的液体状2、 仔细观察底物水解前后的现象。答：对照组：魔芋粉结成团，透明，具有弹性，黏度很大，无法搅拌，实验难以继续。实验组：魔芋粉已被完全酶解，三角瓶中完全是液体状的酶解产物，溶液呈透明状。思考题：以本人液体发酵产酶为例，请详细介绍甘露聚糖酶定量测定的原理与方法。
