1、综合实验一 兔血清免疫球蛋白分离与纯化,主讲教师：申慧芳 岳续朋 生物工程教研室,蛋白质工程实验课,实验课要求,预习不迟到、早退、不旷课、有事请假穿白大褂、注意自我防护不能喧哗，不做与实验无关的事认真完成实验报告值日要求：擦桌子、拖地、擦黑板、倒垃圾、关灯和门窗,一、实验目的二、实验原理三、实验仪器及试剂四、实验步骤五、注意事项六、数据处理及计算,实验一 兔血清免疫球蛋白分离,一 、实验目的,学习并掌握盐析法的原理及用盐析法进行免疫球蛋白分离与纯化的技术。（IgG ）,抗体结构,抗体分子是由两条轻链(light chain, L链)和两条重链(heavy chain, H链)通过链间二硫键连接
2、而成。,二、实验原理一 盐析,当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜减弱甚至消失；同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀，这个过程叫做盐析。,实验原理-盐析,不同蛋白质由于所带电荷不同以及水化程度不同，加入不同浓度的中性盐可分阶段从溶液中沉淀出来。蛋白质盐析中最常用的盐是硫酸铵硫酸铵分级沉淀,三、 实验仪器及试剂,1. 实验材料：血清（兔免疫血清）。2. 试剂：0.01mol/LpH7.4 PBS、0.5 mol/L NaOH、0.5mol/L HCl、饱
3、和硫酸按（用前以5mol/ L NaOH调至pH7.4）、奈氏试剂。,三、 实验仪器及试剂,3. 用具：三角瓶、烧杯、各种吸管、小试管、量筒、布氏漏斗、透析袋（用前用PBS或双蒸水煮沸10min）、饭盒（装碎冰）等。4. 仪器：搅拌器、离心机等。5. 溶液配制,三、实验试剂,饱和硫酸铵溶液的配制： 称（NH4）2SO4400425克，以7080之蒸馏水500ml溶解，搅拌20分钟，趁热过滤。冷却后以浓氨水（28%氨溶液）调PH至7.4。配制好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。,磷酸盐缓冲液,0.2M，PH7.4磷酸盐缓冲盐液（Phosphate Buffered Saline PBS）配制。贮存
4、液：A液： 0.2M NaH2PO4：NaH2PO42H2O 31.2克，加蒸馏水至1000ml；B液： 0.2M Na2HPO4：Na2HPO412H2O 71.7克，加蒸馏水至1000ml； 应用液：取A液19ml加B液81ml混合，再以生理盐水作10倍稀释，加入NaCl至终浓度为0.85%，即为PBS。,柰氏试剂,HgI 11.5g，KI 8.0g，加双蒸水至50ml；搅拌溶解后过滤，滤液中再加入浓度为20%的溶液NaOH 50ml。,四、实验步骤,1 兔免疫血清的制备,2 硫酸铵分级沉淀,（1）取制备好的血清20ml，逐滴加入（NH4）2SO4饱和溶液20ml，使成50%（NH4）2S
5、O4溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置10min。（2）3000r/min离心10min，弃去上清。（3）用6ml磷酸盐缓冲液溶解沉淀，再加（NH4）2SO4饱和溶液3ml，使成33%（NH4）2SO4溶液，充分混合，静置10min。（4）3000r/min离心10min，弃上清。（5）为进一步纯化，可重复步骤3 23次。,3 透析去盐,（6）用5mlPBS溶解沉淀，装入透析袋。（7）透析除盐，中间换液数次，至奈氏试剂测透析外液无黄色。,五、数据处理及计算,蛋白含量（mg /mL）（1. 45OD 280nm 0. 74 OD 260nm） 样品稀释度 注：式中1.45与0.74为常数，nm为波长。,蛋白质及其定量鉴定：取样品少许作适量稀释，以紫外分光光度计测量蛋白含量 260、280nm处读数,实验报告的要求,题目、原理、主要试剂与器材、步骤、结果、注意事项（心得体会）班级、姓名、学号由学习委员统一收齐，按学号从小到大顺序放好自己写、书写整齐订成一本或每次分开,
