1、蛋白质生化技术,南开大学生命科学学院Protein Biochemistry Lab Nankai University 叶丽虹,SELDI蛋白指纹技术GST Pull-Down报告基因系统PTDs,蛋白质芯片-飞行质谱系统及其在分子生物学中的应用,背景介绍,蛋白指纹质谱技术（SELDI，Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization，表面增强激光解吸技术）是 2002年诺贝尔化学奖的核心技术，具有快速、简单和灵敏等优点,它不仅可在肿瘤诊断中用于发现标志物、观察治疗效果,还可用于研究蛋白质的修饰、相互作用、信号传导和酶促调节等,从而实现在蛋白质水平的大
2、规模功能研究。,传统蛋白组学研究（2D-MS）的局限性,由于外加电场下的PH梯度不稳定，重复性差 加样量小，分离的蛋白质很难鉴定可分析的蛋白质最多约1500种，难以检出蛋白质中占很大比例的低丰度蛋白质对于分离跨膜蛋白仍是技术难点电泳胶上的蛋白质斑点很大部分包含一种以上蛋白，以依次鉴定单个蛋白斑点为基础，限制了检测通量消耗时间长，一次电泳要5小时以上 对技术水平要求高，不能完全自动化染色转移等环节操作技术条件要求高，耗时，不适应于大规模筛查和临床检测,SELDI技术的优势,直接用粗生物样品（血清、尿、体液）进行分析 同时快速发现多个生物标记物微量样品 (as few as 2000 cells
3、for LCM samples)高通量的验证能力（ with 1000s of samples a month）发现低丰度蛋白质 测定疏水蛋白质: 与“双相电泳加飞行质谱”相比，除了有相似功能外，并可增加测定疏水蛋白质在同一系统中集发现和检测为一体,特异性高 ：利用单克隆抗体芯片，可鉴定未知抗原/蛋白质，以减少测定蛋白质序列的工作量可以定量：利用单克隆抗体芯片，由于结合至芯片上的抗体是定量的，故可以测定抗原量，但一般飞行质谱不用于定量分析功能广 ： I.利用单克隆抗体芯片, 可替代 Western Blot II. 利用单克隆抗体芯片, 可互补流式细胞仪不足的功能，如将细胞溶解，可测定细胞内的
4、抗原, 而且灵敏度远高于流式细胞仪,系统介绍,SELDI技术的蛋白质芯片飞行时间质谱仪器由三部分组成：蛋白质芯片阅读器（Protein Chip Reader）飞行时间质谱检测系列（PBSIIC系列）分析软件（Protein Chip软件）。,操作流程示意图,生物初样品（血清/细胞裂解液）：蛋白质通过亲合作用结合到芯片的化学或生物位点上；清洗蛋白质芯片：用水洗去非特异性结合的蛋白质和缓冲液中的杂质，以消除干扰；加能量吸收分子 EAM（Energy Absorb Molecule） or “Matrix”：芯片 经室温干燥后，加能量吸收分子 EAM到每个 点上，使其与蛋白质结成混合晶体，以促进蛋
5、白质在飞行时间质谱检测中的解吸附和离子化,SELDI蛋白质芯片的制备,1,2,3,飞行时间质谱检测,激光解吸电离的方法将保留在芯片上的蛋白质解离出来电离的蛋白质可以通过飞行时间质谱被精确地测定出它们的质量,Protein Chip Reader工作草图,Protein Chip 软件,化学表面芯片,分为疏水、亲水、阳离子、阴离子和金属离子螯合芯片五种，用于检测未知蛋白，获取指纹图谱。化学表面芯片可以直接用粗生物样品（血清、尿样、体液）进行分析，能同时快速发现多个生物标记物，测定疏水蛋白质特别是膜蛋白。,芯片的种类,生物表面芯片,生物表面芯片分为抗体抗原、受体配体和DNA蛋白质芯片等种类，可显示
6、与之相结合的抗原或者配体的不同分子量亚型，这种芯片的特异性高，可以定量。,蛋白质芯片系统提供了一个单一、快速和特异的平台，成为蛋白质组学研究的多个领域的强大平台。 能够用于下列研究：生物标志物发现、表达差异绘图、作用差异绘图、抗体抗原作用、DNA与蛋白的相互作用、蛋白鉴定和多肽作图、蛋白质纯化、表位作图、糖基化分析、磷酸化/信号传导途径分析、蛋白与蛋白之间作用、受体配体作用、毒性标志物发现、临床数据分析等。,在发现生物标志物上的优势,抓住了疾病的本质，绝大多数疾病都有特异的生物标志物（Bio-marker），在SELDI技术中质谱的峰值是对这些生物标志物最直接的反映。有一套灵敏的检测系统来检测
7、和识别这些微量的生物标志物 。,发现生物标志物,能够对许多不同的样品进行比较分析，软件功能强大，分析获得的谱图可以多种形式表示，并应用叠加合成等手段筛选出特别的差异峰，从而确定生物标志物，该方法迅速便捷。,蛋白质纯化,提供了便捷的蛋白质纯化方法，能够优化最佳色谱条件（如PH值、洗脱条件），对目的蛋白质进行有效的分离。,蛋白质鉴定,从蛋白质芯片对结合的蛋白质进行消化，或者事先对蛋白质混合物进行蛋白酶切处理，再结合到蛋白质芯片。结合质谱分析，能够得到消化片段的分子量，从数据库中进行检索就能够获得相应蛋白质的序列信息。,分子间作用,预先对芯片的点进行处理，偶联抗体或者其他蛋白（或者其他的诱饵分子），
8、制备定制芯片。将待检测包含可能结合分子的溶液与芯片进行杂交，洗脱后对结合上的绑定蛋白质进行质谱分析，获得结合蛋白质的相关信息。,转录后修饰,能够确定样品中特定分子量的蛋白质，而这些蛋白质的各种修饰对分子量的改变导致了获得相应峰的位移，从而精确表述蛋白质的修饰状况。,临床应用,蛋白质指纹质谱技术目前已经广泛应用于多种疾病，如癌症、老年病、传染性疾病、心血管病和神经系统疾病的临床诊断，其中应用于癌症的最多，被认为是分子医学的一场革新，极大的提高了各种疾病的诊断率。,疾病的诊断、疗效监测和预后判断,肿瘤：前列腺癌 乳腺癌 卵巢癌 膀胱癌 白血病 肺癌 脑癌 大肠癌其它疾病：急性肾功能衰竭 急性心力衰
9、竭, 动脉硬化症 暴露在空气中的毒素神经精神病学 ：早老性痴呆 忧郁症 精神分裂症 巴金森氏 Huntingtons 传染病：HIV 鼠疫杆菌Yersinia pestis 分支杆菌Mycobacterium 柄细菌Caulobacter 链球菌Streptococcus 肉毒中毒Botulism 盶病毒Prions 黑死病病毒 Yersinia,临床诊断肿瘤,肝癌 甲胎蛋白AFP 91% 89% 肺癌 NSE 82% 95% 胃癌 癌胚抗原CEA 91% 94% 前列腺癌 PSA 83% 97% 乳腺癌 癌抗原CA153 93% 91% 卵巢癌 癌抗原CA125 99% 99% 肠癌 癌胚抗
10、原CEA 83% 92% 胰腺癌 CA199 82% 85% 膀胱癌 尿液检测 93% 87% 鼻咽癌 92% 97% 食道癌 84% 91% 喉癌 97% 97%,肿瘤 传统标志物 灵敏度 特异性,SELDI肿瘤蛋白指纹,发病机理研究,著名的艾滋病学家何大一教授借助SELDI技术，在3个月内所定了-defensin 1，2，3 三种蛋白对艾滋病有抑制作用，这是正常人体内没有的蛋白质，这一发现使研制艾滋病蛋白抑制剂一直成为可能。乙肝病毒感染-肝硬化-肝癌是导致乙肝患者最终死亡的发病三步曲，通过SELDI，检测乙肝病毒携带者、肝硬化及肝癌病人的血清蛋白，发现三种疾病的质谱峰，检测其它样品时灵敏度
11、为80%，特异性为81.8%，这种手段无创伤，并且可以不间断的跟踪检测，为正确治疗提供科学可靠的技术依据。,其他应用,新药开发与药理学研究，药物毒性实验等，利用SELDI技术可以准确的侧到药物中的特异基因，活性基因与灭活基因。对临床用药具有很好的有指导作用 。基础理论研究：蛋白质的纯化，蛋白质的鉴定，蛋白质功能的研究，已知样品中某种功能蛋白，可通过该技术寻找功能蛋白。蛋白质与蛋白质相互作用研究，如有已知抗体、受体酶，可用该技术获得其靶蛋白（抗原、配体和底物），形成DNA或者RNA结合蛋白的研究，确定抗原决定簇，蛋白质磷酸化，糖基化研究，用于寻找与疾病有关的磷酸化，蛋白及新型生物标志物的开发与应
12、用等。,GST Pull-Down（谷胱苷肽-S-转移酶沉淀试验）方法寻找结合蛋白,Protein Biochemistry Lab Nankai University,背景,蛋白质间相互作用的研究作为了解蛋白质生物功能的重要手段之一，在功能基因组学研究中极为重要。蛋白质间相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中。生物学中的许多现象如细胞凋亡、细胞周期调控、信号转导和癌变等均受蛋白质间相互作用的调控。,Protein Biochemistry Lab Nankai University,简介,GST Pull-down技术是近年来发展的一种敏感性及特异性均较高的体外鉴定两蛋白之间相互作用的重
13、要方法1991年由Kaelin的研究组最早应用GST Pull-down技术在混合蛋白溶液寻找到结合蛋白利用谷胱甘肽硫转移酶（glutathione S-transferase，GST）融合蛋白对谷胱甘肽偶联球珠的亲和性，从可能含有相互作用蛋白的溶液中纯化相互作用的蛋白,Protein Biochemistry Lab Nankai University,实验步骤,原核表达并纯化GST融合的已知蛋白。同时，应用放射性同位素（ 35S）对细胞裂解物进行标记。将GST融合蛋白与标记好的细胞裂解物混合，同时加入谷胱甘肽偶联球珠，温浴使得融合蛋白的GST能够与球珠结合。通过离心方法收集GST融合蛋白以
14、及与其结合的可能的蛋白分子 。在收集到的混合物中加入谷胱甘肽或者直接煮沸，使得目的的混合物能够从球珠上洗脱下来，溶解在SDS-PAGE 上样缓冲液中。将获得的混合物进行SDS-PAGE电泳，进行放射自显影或者蛋白染色，进而转膜进行Western blotting 实验鉴定。还可应用质谱的方法对找到的结合蛋白进行分析，确定未知蛋白的氨基酸组成，从而找到与已知蛋白结合的因子。,Protein Biochemistry Lab Nankai University,应用,确定融合蛋白与未知蛋白间新的相互作用证实融合蛋白与已知蛋白质间可能的相互作用,Protein Biochemistry Lab Na
15、nkai University,GST Pull-Down检测蛋白的作用,原核表达的已知蛋白细胞裂解液中的未知蛋白质应用cDNA文库，进行体外翻译的蛋白质文库中的未知蛋白半定量检测蛋白与蛋白的亲和作用,Protein Biochemistry Lab Nankai University,GST,Protein X,GST,35S-labled cell lysate,(glutathione-sepharose beads),(glutathione-sepharose beads),35S-labled cell lysate,GST,Protein X,GST,GST,Interact a
16、t 40C,Microfuge to collect complexes,Protein Biochemistry Lab Nankai University,实验步骤,1 2 3,autoradiograph,Analyze by SDS-PAGE,Lane1. MarkerLane2. GST-proteinXLane3. GST,GST,GST,Protein X,Protein Biochemistry Lab Nankai University,实验步骤,Protein Biochemistry Lab Nankai University,Protein Biochemistry L
17、ab Nankai University,GST pull down验证两种已知蛋白质的相互作用,举 例,input,GST,Y-GFP + + +,X-GST,Y-GFP,X-GFP + + +,GST,input,105kD,Anti-GFP,Anti-GFP,Y-GST,X-GFP,Protein Biochemistry Lab Nankai University,报告基因系统,gene；luciferase；green fluorescent protein 报告基因(report gene)是指一组编码易被检测的蛋白质或酶的基因，将其与目的基因融合表达后，可通过报告基因产物的表达来
18、“报告”目的基因的表达调控。这项技术灵敏度高、检测简便可靠、适于大规模生产，因而在监测细胞信号转导，基因表达和药物筛选等方面得到广泛应用。一般的报告基因需要满足以下几个条件：(1)基因被克隆并且已知全序列；(2)宿主不存在报告基因产物或者不存在类似的内源性物质；(3)表达产物易被检测；(4)报告分子的分析结果应具有很宽的线形围，以便分析启动子活性的幅度变化?；(5)报告基因在细胞或动物内表达对其正常的生理作用或活性没有影响。现主要以目前应用最广泛的报告基因荧光素酶和绿色荧光蛋白为例，综述报告基因的新近应用研究进展。1 荧光素酶(1uciferase，luc) luc是能催化荧光素或者脂肪醛氧化
19、发光的一类酶的总称。根据来源不同主要分为细菌荧光素酶(bacterial luciferase，BL)、萤火虫荧光素酶(firefly luciferase，FL)以及以海星、发光鱼、发光甲虫等为来源的荧光素酶，目前研究最广泛并且成为商品酶的是BL和FL。,报告基因的研究背景,要研究基因的功能，基因的调控机制非常重要，基因的表达产物很复杂并难以准确的定量和定性。研究报告基因系统成为一种简单的研究基因调控的方法。对真核基因调控的了解，主要来自野生型和突变型的假定顺式作用调控元件的活性测定实验，是在转染的真核细胞中进行的。在大多数情况下不直接测定调控元件的调节转录速率的能力,而是把顺式调控元件与一
20、种编码新的产物的,被称为报告基因的基因序列连接起来,在基因的转录过程中,测定报告基因的转录产物的量,来判断顺式调控元件的调控能力。,一般的报告基因需要满足以下几个条件：基因被克隆并且已知全序列；宿主不存在报告基因产物或者不存在类似的内源性物质；报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵敏度高而且重现性好；细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的检测。报告基因的表达同样也不能影响或改变细胞正常的生理活性。报告分子的分析结果应具有很宽的线形围，以便分析启动子活性的幅度变化；报告基因在细胞或动物内表达对其正常的生理作用或活性没有影响。,报告基因通常是在报告基因载体质粒中与被检测基因序列相连, 提取
21、大肠杆菌中扩增的质粒,转染入目的真核细胞中。与此同时还要将一有真核启动子和增强子的另一种报告基因质粒,共转染同一细胞,以作为转染率的内对照。 目前已有很多的方法用于报告基因的测定如: 比色法、荧光法、生物发光法、化学发光法、酶联免疫法及原位染色法及流式细胞仪法。,报告基因的种类 氯霉素转乙酰酶报告基因(chlormnphenicol acetyl transferase,CAT) 细菌的CAT酶能将乙酰基从乙酰辅酶转移到氯霉素上,而使其失去抗菌性。该反应能通过测量放射性标记的底物而量化。放射性同位素标记底物有3标记的乙酰辅酶和14标记的氯霉素或用荧光素标记其中之一。CAT抗体可用于ELISA法
22、检测CAT。 优点：在真核细胞中的本底很低；结果的重现性很好；灵敏度很高。 缺点：只能用细胞提取物进行测定；测定的范围很窄；可能有放射性同位素的污染。, 半乳糖苷酶报告基因(galatosidase, gal) 大肠杆菌编码的gal能水解乳糖为半乳糖。虽然在很多细菌、植物和动物细胞中存在较高的本底,而限制了它的使用,但常用做转染的参照体系。通过使用特定的方法,还能够区别内外源性的 gal(改变缓冲液的等) 检测方法:比色法、荧光法、化学发光法、FACS等。, 葡萄糖苷酸酶( glucuronidase, GUS)报告基因 是大肠杆菌的又一水解酶,它能水解葡萄糖苷酸。 主要用于缺乏该酶的病毒性植
23、物病原体、植物、酵母、及真菌等的研究中,在医学研究中相对应用较少。 相关产品 ICN公司的Aurora GUS试剂盒 ，应用了MUG(4 methylumbelliferyl D glucuronide)使实验的灵敏度比同类的荧光分析更加灵敏，且能使存在动植物细胞中的荧光本底降低很多,分泌型碱性磷酸酶(Secreted alkaline phosphatase, SEAP)报告基因 该酶为人胎盘碱性磷酸酶(PLAP)的突变体,也有从北大西洋海域中的耐热细菌中分离出耐热型AP。 由于该酶能分泌到细胞外,在检测时,可以在不破坏细胞的情况下,任意时间都可以取细胞培养上清液进行重复的、动态的检测, 还
24、可以用做其它的用途。,荧光素酶(luciferase, luc)报告基因 该酶克隆于北美洲萤火虫的荧光素酶基因,它能催化甲虫的荧光素的氧化性羧化作用,发射出光子,能被光度计或闪烁计数器捕获定量。 快速、方便,更具有很好的浓度线性范围(具有78个数量级的线性范围),而被广泛应用。 能在合成时与蛋白产生融合蛋白,该酶的检测灵敏度达10-20 mol,且该酶的半衰期很短,在评价基因的表达物的诱导效应的瞬间分析中具有较好的效果。 在化学反应中通过降低反馈抑制而使信号更加稳定,使其检测可以用液闪法或光照度计法进行检测。,绿色荧光蛋白(GFP）报告基因 该基因来源于西北太平洋海域的水母。该蛋白在紫外光下发
25、射荧光,而可以被多种方法检测。该报告基因检测不需要底物。 绿荧光蛋白在加热、变性剂、去垢剂及一般的蛋白酶均不能使它灭活。可用荧光显微镜或荧光激活的FACS进行检测, 能在活细胞条件下观测,而且能进行细胞内的定位分析。能在转基因小鼠中以无害的形式整合于小鼠的DNA中。,报告基因的应用,启动子活性分析基因转移分析信号转导通路的活性检测受体功能鉴定细胞毒性检测生物大分子的相互作用药物开发的生物筛选,蛋白转导或细胞转导肽 (PTDs),细胞内转导肽, 概念,一些蛋白质如HIV 的TAT蛋白、果蝇转录因子Antp、HBV的前S抗原等可以进入细胞。其特定结构域（一般10-30个氨基酸）对其进入细胞发挥主要
26、作用。如果将这一结构域可以携带生物大分子以非受体依赖方式进入细胞。这些具有携带生物大分子进入细胞的多肽统称为细胞转导肽（Transduction peptide）或蛋白质转导功能区（protein transduction domain, PTD）。,病毒蛋白TAT和VP22从感染细胞到非感染细胞的扩散。蛋白转导的可能作用机制：非受体特异性的转导途径。 经典的转导途径：受体-运输小体-内涵体（或胞饮作用） 蛋白转导：富含精氨酸和赖氨酸的蛋白结构易于和带负电 的磷脂膜结合。转导的非折叠构象进入细胞内重新再折叠。,三种主要的蛋白转导系统：HIV-1 TAT, HSV VP22, Antp Antp
27、所能结合并转导到细胞内的蛋白大于100氨基酸； TAT, VP22可携带大于1000个氨基酸,蛋白转导系统的三种产生途径,蛋白转导系统中肽段的人工合成：并且与蛋白转导结 构域结合的肽段可交联成大蛋白。转染TAT或VP22的表达载体于细胞中，融合蛋白在细 胞中表达，在由原始的转染细胞分泌而进入周围未 转染细胞。 TAT融合蛋白在细菌中大量表达，分离纯化后加到培 养液中。,TAT蛋白转导系统,( A )构建原核表达载体-将表达TAT的基因片段与目的蛋白的基因片段连接,TAT融合蛋白表达载体的构建,(B) TAT融合蛋白的大规模纯化 裂解并用尿素变性后分离纯化出需要的融合蛋白(应用8 M 尿素或者6
28、M的盐酸胍能够有效的破坏细菌的包涵体，使所需的重组融合蛋白能够释放).纯化的融合蛋白是变性的，但是一旦转导入细胞，在细胞内部的HSP90等分子伴侣的作用下，就能够正确折叠具有活性功能的蛋白.,(C) 融合蛋白表达分析 1. 构建好的融合蛋白表达载体转化至 BL21菌种。 2. 从转化的平板上挑出6-12个单菌落，各自在1ml的Amp抗性 LB培养基中过夜培养，该培养基中含有诱导 剂(IPTG)，浓度为100 M。 3. 将菌体离心沉淀并重悬于 2SDS 的样品缓冲液中，通过SDSPAGE电泳进行融合蛋白表达的分析，挑选出融合蛋白表达最多的菌种。 4. 将SDSPAGE电泳的胶进行转膜，应用HA
29、标签的抗体或者所融合目的蛋白的抗体进行Western-blotting证实融合蛋白的表达。,( D )蛋白转导实验以及检测 应用Fluorescein (FITC)等标记转导的融合蛋白,采用荧光显微镜或者流式细胞仪技术可以对蛋白转导进行检测或分选。 采用免疫组化可能对 TAT融合蛋白进行定位。 现在已有了TAT-GFP载体，在融合蛋白中构建了绿色荧光蛋白，能够对蛋白转导示踪。,蛋白转导系统与基因转染的比较（优点）：, 转导效率高：所有的真核细胞均能被蛋白转导，包括有 壁的酵母细胞，原代培养的细胞和所有基因转染和逆病 毒转染效率低的细胞。 发生作用快，在无血清的培养液中15分钟内起效。 可定量，细胞内的融合蛋白浓度可严格控制。 转导过程中宿主细胞损伤较小 融合蛋白还能够转导入活体动物的细胞和各个组织，并 具备有穿越血脑屏障的能力可转导整个动物体。,蛋白转导系统与基因转染的比较（缺点）：, 可携带的目的蛋白15-120KDa。 有部分融合蛋白在细菌表达体系中产量低，且缺 少转录后修饰。 融合蛋白的定位差。 作用时间短，6天后作用消失。,祝“十一”、“中秋”快乐！,质谱仪分析蛋白质相互作用网络,“十一”、“中秋”快乐！,
