1、 ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书( 2005 版) 第 1 页申请书版本号：50456793 同行评议组别 生理、病理及病理生理学项目编号 Y205695浙江省自然科学基金申 请 书申报类别: 一般项目项目名称: 促红细胞生成素受体在心肌缺血再灌注过程中的表达及功能申 请 者: 叶挺梅电 话: 0578-2271390依托单位: 丽水学院通信地址: 丽水市丽水学院科研处邮政编码: 323000E-mail : 申报日期: 2005-5-30浙江省自然科学基金委员会二 OO 五年制ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书( 2005 版) 第 2 页申请书版本号：50456793 基本信息姓
2、名 叶挺梅 性别 女 出生日期 1954 年 04 月 01 日最终学位 其他 获学位年份 职称 副教授主要研究领域心血管呼吸生理与药理 E-mail 电 话 0578-2271390 个人网页 依托单位 丽水学院证件类型 身份证 证件号码 332521540228002申请者是否近三年调入在浙单位工作 否 调入时间 申请者曾主持的浙江省自然科学基金资助项目编号:申请者信息 申请者正在主持的国家和省部资助经费在 20 万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限:项目名称 促红细胞生成素受体在心肌缺血再灌注过程中的表达及功能申报类别 一般项目 研究属性 前瞻性应用基础研究同行评议组别 医药科学/生
3、理、病理及病理生理学依托基地名称 预计研究年限 2006 年 01 月2008 年 12 月总经费预算 8.0 万元 申请经费 8.0 万元项目研究目标、内容和意义简介(限 400 字)研究缺血性心脏病时 EPO 受体的表达和功能。探讨心肌细胞表达 EPO 受体的调控机制，缺血再灌注损伤时心肌组织 EPO 受体表达分布和时间特征，以及外源性 EPO 的心脏保护作用与心肌 EPO 受体功能的关系。同时，观察外源性 EPO 治疗对于心脏 EPO 受体表达情况的影响等。通过研究以明确缺血性心脏病时是否存在 EPO/EPO 受体的内源性保护机制和外源性 EPO 治疗的最佳时间窗，为临床使用 EPO 治
4、疗急性心肌缺血性损伤提供实验依据。关键词（不超过 4 个） 心肌；促红细胞生成素；受体；缺血再灌注同行评议分组说明 疾病的生理、病理及病理生理学基础 项目基本信息重点资助方向 重要疾病机理及防治研究ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书( 2005 版) 第 3 页申请书版本号：50456793 项目组主要成员编号 姓名 出生日期 性别 职称 学位 单位名称 电话 项目分工每年工作时间（月）（(月)1 叶挺梅 1954 年 04月 01 日 女 副教授 其他 丽水学院 0578-2271390 负责人 62 任少华 1953.08.15 男 主任医师 学士 丽水市中心医院 0578-220635
5、5 临床试验 33 秦丽君 1953.06.01 女 主治医师 其他 丽水市中心医院 0578-2280026 分析试验 34 陈伟伟 1958.03.06 男 主任医师 硕士 丽水市中心医院 0578-2681120 临床试验 45 郭伟 1973.04.06 女 讲师 硕士 丽水学院 0578-2271330 基础实验 86 陈楠 1975.04.06 女 助教 学士 丽水学院 0578-2271330 基础实验 107 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 参加单位数6 3 2 1 0 0 0 1说明：1.个人介绍部分申请者必须填写，其他人员可以不填写；2.高级、中级、初级、
6、博士后、博士生、硕士生及参加单位数由申请者负责填报，总人数自动生成；3.第一人必须是申请者，信息从前面自动读入，但每年工作时间必须手工录入。ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书（2005 版） 第 4 页申请书版本号：50456793个人介绍：叶挺梅：大学本科，副教授，浙江大学动物科学院兼职硕导，浙江省生理科学理事。主要从事医学生理学、生物学等生命科学研究。积累了丰富经验，已发表论文及教材共 30 余篇（本） ，其主要发表学术论文有：1、 叶挺梅、任少华、秦丽君，钝性心肌挫伤临床诊断的研究进展，医学综述杂志， 2005 年 5 月第5 期。2、 叶挺梅，丽水市社区居民心脑血管病危险因素调查，浙
7、江预防医学， 2004 年第 16 卷第 7 期。3、 叶挺梅、叶治国、高琴、夏强，线粒体 SLO1 通道激活引起的心肌保护作用涉及线粒体渗透性转换机制，浙江大学学报（自然科学版）2005 年第 6 期。4、 叶挺梅、朱满莲，消化系统恶性肿瘤病人及家属心理健康状况调查，中国健康心理学杂志，2005 年第 13 卷第 3 期。5、 叶挺梅，关于慢性阻塞性肺部疾病急性恶化的临床研究进展，医学综述杂志， 2000 年第 6 卷第6 期。6、 叶挺梅，生理学多媒体仿真教学的改革与探讨，丽水学院学报， 2004 年第 26 卷第 7 期。7、 叶挺梅，类风湿性关节炎患者在骑车和水中奔跑时的心肺反应，国外
8、医学， 1994 年第 4 期。8、 叶挺梅，副主编，生理学纲要及试题，中国科学技术出版社出版， 2002 年 1 月。9、 叶挺梅，主编，人体生理学目标检测，人民中国出版社出版， 1998 年 12 月10、 叶挺梅，主编，生理学学习辅导，中国科学技术出版社出版， 1994 年 12 月。主要主持的项目：1、 菊米对心血管作用的有效成份及其提取技术研究，项目编号： 2004C33104，浙江省科技厅项目，资助 15 万元，研究起止年月：2004 年 1 月至 2005 年 12 月。2、 混胺铂类配合物的合成及其抗肿瘤作用的研究，项目编号： 20040496，浙江省教育厅项目。3、 欠发达地
9、区中老年身心健康研究，项目编号：KY04003，丽水学院校级项目，立项时间：2004年 3 月。学术奖励：1、获第十二届（2001-2002 年）浙江省自然科学优秀论文二等奖（证书编号：032087003）2、获丽水学院教师现代教学技能比赛三等奖，证书编号： 2003145 任少华： 主任医师，从事心血管、呼吸方面研究，现任丽水中心医院呼吸科主任医师、科教科副科长。是国家级刊物国外医学呼吸分册第三届编委会和国外医学肿瘤学分 册第二届编委会特邀编辑。在心血管和呼吸专业领域具有较高的学术造诣。率先开展了“纤维支气管镜替代胸腔镜检查和治疗” “纤维支气管镜引导下经鼻气管插管”， “经纤维支气管镜选择
10、性支气管造影 ”， “根据支气管肺泡灌洗液内毒素水平快速诊断革兰氏阴性菌肺炎”和“控制性高碳酸血症机械通气治疗”和“胸管负压吸引引流治疗巨型肺大疱”（该技术被北平医药信息中心收编于 中国疑难病求医问药信息库 ）等诊疗新技术。善于学习引用国际先进医学科学技术，应用于临床实践，积极总结临床经验和引进先进医学知识，在中华结核和呼吸杂志 、美国Chest 和英国 Thorax等大型权威杂志发表临床论文篇，其中多篇被Biological Abstract ， Current Science 等国际索引文献收录。多次获省自然科学论文奖。 在国家级刊物发表综述文章 50 余篇，文摘 200 余篇。公开发表文
11、字 40 余万，连续三届荣获“世界科技译报” 好译者奖。丽水市第三批有突出贡献中青年专业技术人才。ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书（2005 版） 第 5 页申请书版本号：50456793ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书（2005 版） 第 6 页申请书版本号：50456793申请经费预算 8.0 万元计划开支项目名称 计算根据及理由 金额（万元）1信息费资料费文印费上网信息费论文版面费0.52专题学术活动费国际国内学术会议差旅 会务费 国内外期刊论文版面费0.53仪器和设备购置费实验等相关仪器如显微镜电子天平0.54能源材料费公办耗材费实验动物实验药品等5.55计划管理费按学校规定提
12、取0.46人员费加班等补助费0.6注：开支范围和标准参见浙江省省级科技项目经费管理暂行办法 （浙财教字200220号） 。 ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书（2005 版） 第 7 页申请书版本号：50456793申请者承诺：我保证： （1）申请书内容是真实的；（2）恪守科学道德，伦理道德的基本原则；（3）项目组成员知晓申请书内容，并自愿参与研究工作；（4）已如实填报申请者正在主持的国家和省部资助经费在 20 万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限；（5）如果获得资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守浙江省自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，认真开展工作，按时报送有关材料
13、。若填报失实或违反规定，本人将承担全部责任。签字： 日期：项目依托单位承诺:已按规定对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申请项目如获资助，我单位保证对计划实施所需要的人力、物力和工作时间等条件给予保障，严格遵守浙江省自然科学基金委员会有关规定，督促项目组遵守科学道德和伦理道德的基本原则，督促项目负责人和本单位项目管理部门按照规定及时报送有关材料。依托单位公章 日期 .ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书（2005 版） 第 8 页申请书版本号：50456793促红细胞生成素受体在心肌缺血再灌注过程中的表达及功能1、项目研究意义随着溶栓和急诊介入治疗的广泛开展，心肌梗死患者短期和长期的生存率得
14、到显著提高，但仍有相当部分存活的患者随后发生进行性心力衰竭。缺血/再灌注导致的心肌损伤是目前心机梗死治疗中有待解决的关键问题，有文献报道，心肌缺血/再灌注过程中凋亡的发生是导致心肌损伤的重要机制之一 1。凋亡是细胞程序性死亡，因此，可以通过早期干预减少凋亡的发生，从而降低心肌在缺血复灌过程中的损伤 2。在动物实验中已经证实，应用抗凋亡药物，细胞因子或采用基因治疗可减轻心肌缺血/ 再灌注损伤。但目前某些抗凋亡方法尚不能应用于临床，而已有抗心肌再灌注损伤的临床试验未见显著的心肌保护作用 1。因此，有必要探索一种既可用于临床，又具有显著心肌保护作用的治疗方法，作为心肌梗死再灌注治疗的辅助治疗，以减轻
15、心肌损伤。促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO ）是第一个被克隆的造血生长因子，以往主要用于促进红细胞生成以纠正贫血，在临床上已被广泛使用十余年。其造血活性的主要机制为抑制晚红系祖细胞凋亡而非直接刺激细胞生成 3。随着 EPO 受体在脑、肝脏、子宫等器官及实体肿瘤组织的发现，EPO的髓外作用日益受到重视 4。近十年的研究主要集中于 EPO 的脑保护作用， EPO/EPO 受体通过抗凋亡、抗炎、抗氧化等机制，可预防或减轻神经系统缺血/再灌注损伤 5。一项已完成的 EPO 对缺血性中风病人安全性和疗效的随机双盲临床试验，对于中风 8 小时内的患者，连续 3 天经静脉使用重组EPO（
16、recombinant EPO, rEPO） ，观察 30 天显示 rhEPO 对于急性缺血性中风患者能有效缩小梗塞面积和改善临床表现 6。同时在心肌细胞也发现 EPO 受体的存在。已有研究表明 EPO 可在细胞水平显著减少缺氧诱导的大鼠心肌细胞凋亡，同时器官水平研究表明 EPO 可减少缺血再灌注心肌损伤和梗死心肌的范围，改善心功能 7。在缺血再灌注的不同时期，包括心肌缺血前、缺血时及再灌注时使用单一剂量 rEPO 均能产生显著心肌保护作用 8。由于单一剂量 EPO 治疗后 35 天才可见外周循环中红细胞增加，因此 EPO 的心脏保护作用与增加红细胞浓度无关，直接保护机制可能包括：（1）减少心
17、肌细胞凋亡；（2）稳定内皮细胞和促进血管生成 9；（3）动员骨髓内皮祖细胞 10；（4）减轻缺血和再灌注引起的炎症反应 11等。体内 EPO 主要由肾脏分泌入循环，EPO 和细胞膜的 EPO 受体结合发挥生物活性，激活多种信号转导途径发挥抗凋亡作用 12。多种神经细胞可分泌 EPO 和表达 EPO 受体，EPO/EPO 受体系统被认为是脑缺血损伤的内源性保护机制，在脑缺血/再灌注或持续局部脑缺血时，神经细胞上调 EPO 受体和分泌 EPO 增强，并且上调 EPO 受体要早于增加 EPO 分泌 13，14 。EPO 受体在成年大鼠心肌细胞、内皮细胞和纤维母细胞均有表达 15，细胞 EPO 受体表
18、达可能与缺氧，胰岛素样生长因子（insulinlike ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书（2005 版） 第 9 页申请书版本号：50456793growth factor, IGF） ，肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF） ，白介素-1（interleukin, IL-1）和白介素-6（interleukin6, IL-6）等有关 4。目前尚无心肌组织分泌 EPO 的证据，调控心肌细胞 EPO 受体表达的因素尚不明确，对于心肌梗死时是否也存在 EPO 受体上调尚不清楚。EPO 受体的表达分布和时间，对于外源性 EPO 的治疗效果起决定作用。在大鼠离体心脏L
19、angendorff 灌注模型中，40min 缺血和 2h 再灌注，EPO 受体的表达量和在心肌细胞内皮细胞和纤维母细胞的表达分布未见显著改变，并且发现外源性 EPO 治疗使心肌组织 EPO 受体下调 15。是否持续缺血或更长的再灌注时间能使 EPO 受体的表达量和分布产生影响，以及 EPO 治疗是否会导致 EPO 受体持久下调等情况，需进一步研究。本项目研究缺血性心脏病时 EPO 受体的表达和功能。重点探讨心肌细胞表达 EPO 受体的调控机制，缺血和再灌注损伤时心肌组织 EPO 受体表达分布和时间特征，以及外源性 EPO 的心脏保护作用与心肌 EPO 受体功能的关系。同时，观察外源性 EPO
20、 治疗对于心脏 EPO 受体表现情况影响等。通过研究以明确缺血性心脏是否存在 EPO/EPO 受体的内源性保护机制和外源性 EPO 治疗的最佳时间窗，为临床使用 EPO 治疗急性心肌缺血性损伤提供实验依据。2、项目研究目标及与申请者研究工作长期目标的关系研究目标：探索心肌细胞表达 EPO 受体的影响因素，明确心肌缺血损伤时是否存在 EPO/EPO 受体的内源性保护机制。探索外源性 EPO 对于心肌保护作用及与 EPO 受体表达的关系，明确 EPO 治疗的时间要求。EPO 治疗缺血性心脏病提供实验依据。与申请者研究工作长期目标的关系：本课题组成员长期从事心血管疾病治疗和细胞移植治疗的研究，在心血
21、管生理学、细胞生物学分子生物学、分子遗传学和病理学等方面做了大量的工作，积累了丰富的理论和实践经验。3、项目研究内容，研究方案和进度安排研究内容：第一部分：体外实验：大鼠心肌细胞 EPO 受体表达及影响因素1、低氧及 IL-6 等细胞因子对体外培养的心肌细胞 EPO 受体表达的影响：观察体外培养的心肌细胞 EPO 受体表达情况，以及在低氧和/或与心肌梗死相关的 IL-6 等细胞因子对于心肌细胞 EPO 受体表达的影响。2、外源性 EPO 对缺氧心肌细胞损伤的保护作用及 EPO 受体的表达变化：观察外源性 EPO 对于心肌细胞的保护作用，以及 EPO 处理对于心肌细胞表达 EPO 受体的变化。第
22、二部分：在体实验：缺血损伤对于心肌细胞表达 EPO 受体的影响ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书（2005 版） 第 10 页申请书版本号：504567931、缺血性损伤时心肌表达 EPO 受体改变及分布：观察缺血再灌注及心肌梗死模型中缺血区域心肌细胞、内皮细胞及间质细胞表达 EPO 受体情况及随时间的改变。2、缺血性心肌损伤时循环中 EPO 浓度改变及时间特征：观察缺血再灌注及心肌梗死时循环中 EPO浓度改变，随时间的浓度曲线，以及与 EPO 表达相关的细胞因子水平的改变。3、外源性 EPO 对缺血心肌的保护作用及对 EPO 受体影响：观察外源性 EPO 对于缺血再灌注及心肌梗死的保护作用
23、和 EPO 治疗开始时间及维持治疗对于保护作用的影响。观察外源性 EPO 对于缺血心肌表达 EPO 受体的影响。研究方案：第一部分 体外培养的心肌细胞 EPO 受体表达及影响因素1、新生大鼠心肌细胞原代培养，光镜及免疫细胞化学染色鉴定；2、低氧、低糖、TNF、IL-6、EPO 等单一或复合条件下培养心肌细胞，使用半定量 RT-PCR，Western Blot 和免疫细胞化学染色检测 EPO 受体表达情况。并与正常条件培养的心肌细胞对照。3、低氧条件下培养的心肌细胞中加入不同浓度的 rEPO，TUNEL 法检测凋亡细胞，免疫细胞化学染色检测凋亡细胞和存活细胞表达 EPO 受体表达情况。第二部分
24、缺血损伤对于心肌细胞表达 EPO 受体的影响1、钳夹 3min 或结扎大鼠前降支分别建立大鼠心肌缺血/再灌注和心肌梗死模型。2、再灌注或心肌梗死即刻、2h、6h、12h、24h、4d、7d 等不同时间，使用半定量 RT-PCR，Western Blot 和免疫组织化学染色检测 EPO 受体表达情况，同时以免疫组化确定细胞类型：心肌细胞（TnT、Cardiac myosin） 、内皮细胞（VE-cadherin, factor） 、血管平滑肌细胞（anti-a-smooth muscle myosin）及疤痕组织（1 型和 3 型胶原抗体混合物）的特异性抗原。TUNEL 法检测凋亡细胞。检测不同
25、的时间点血浆 EPO 及 IL-6 等细胞因子浓度的变化。3、分别在建立模型前、再灌注或心肌梗心即刻、心肌梗死后 3h、6h 等不同时间点开始皮下注射不同浓度的 rEPO（1000-5000U/Kg，单交或 1/d*7） ，以假手术组和生理盐水治疗组为对照。4、不同时间获取大鼠心脏，观察心功能主要参数改变，观察梗塞区域病理变化，测定梗死面积，原位凋亡检测和 EPO 受体抗体双染色检测相关区域凋亡细胞数量，以及 EPO 受体表达的关系。关键技术：（1）具有心肌细胞细胞原代培养、细胞移植、基因治疗及动物体内实验等相关研究经验和技术。（2）本校动物实验、病理检测、细胞分类鉴定、凋亡检测及其他实验条件已具备，可配合实验的完成。
