1、CAR-T治疗进展和发展趋势,2012中国肿瘤登记年报,恶性肿瘤已成为严重威胁生命安全和身体健康的重要杀手。全国每6分钟就有一人被确诊为癌症，每天有8550人成为癌症患者，每七到八人中就有一人死于癌症。未来10年，中国的癌症发病率与死亡率仍将继续攀升。预计到2020年，中国每年的癌症死亡总数将达300万左右，患病总数将达660万。,WHO：2014年中国癌症现状,细胞免疫治疗,生物治疗是继手术、放疗、化疗之后又一新的肿瘤治疗技术，掀起了肿瘤治疗的绿色革命，有着广阔的发展前景。美国科学杂志公布年度十大科学突破，其中癌症免疫疗法居于首位。免疫细胞治疗是采集患者外周静脉血， 在 GMP 实验室内分离
2、外周血单个核细胞，在多种细胞 因子诱导下，大量扩增出具有高效抗瘤活性的免疫效应细胞，再通过静脉、皮内注射、介入等回输到患者体，达到增强患者免疫功能和杀伤肿瘤细胞的目的。,免疫细胞治疗的种类,第一代：细胞因子激活的杀伤细胞（LAK），肿瘤侵润淋巴细胞（TIL）。第二代：细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）。第三代：树突状抗原呈递细胞(DC)刺激细胞因子诱导的杀伤细胞 （DC-CIK）。第四代：利用肿瘤靶向抗体（TCR），或者嵌合抗原受体(CAR)。CAR-T免疫细胞治疗是当前科技当中唯一有可能彻底清除癌细胞的方法。,非特异性免疫细胞：LAK，NK，CIK,特异性免疫细胞：TIL,特异性免疫细胞：TC
3、R-T，CAR-T,识别广谱，无特异性，细胞培养易,特异性弱，细胞培养较难,特异性强，需转基因操作,特异性免疫细胞：DC-CIK,特异性弱，细胞培养较易,免疫细胞的种类,CAR-T,在临床上发现肿瘤时，一般已是中晚期，此时病人体内肿瘤细胞占优 势，严重损害了机体的免疫功能，在这样的免疫系统微环境下，DC 细胞功能受损，激活 T 细胞效率较低，攻击癌细胞能力不够，也不够精准；另外，肿瘤细胞通过低表达或不表达 MHC 分子的逃逸机制，逃脱免疫细胞的攻击。这就需要制造 精密制导、精准打击的免疫细胞武器，克服 MHC 介导的杀瘤机制。于是，靶向性抗肿瘤细胞 CAR-T 技术应运而生。 近年来发展的利用
4、基因改造技术表达肿瘤特异性嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)的T细胞显示出的靶向性、杀伤活性和持久性，为过继性细胞免疫治疗注入了新的解决方案。,1989年首次提出和设计通过将识别肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA)的scFv和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs, ITAM, 通常为CD3或FcRI)”在体外进行基因重组, 生成重组质粒, 再在体外通过转染技术转染到患者的T细胞, 使患者T细胞表达肿瘤抗原受体,转染后经过纯化和
5、大规模扩增后的T细胞, 称之为嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。,CART19,CAR-T 技术原理,CAR是将识别肿瘤相关抗原(TAA)的单链抗体(scFv)和T细胞的活化序列在体外进行基因重组，形成重组质粒，在体外通过转染技术，转染经纯化与大规模扩增后的T细胞，称之为CAR-T细胞。CART技术应用范围广泛，针对某种或数种肿瘤相关抗原阳性的肺癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌、鼻咽癌、食道癌、肾癌、膀胱癌、胃癌、黑色素瘤、淋巴瘤等恶性肿瘤均可治疗。,CAR-T 技术发展历程,CAR-T细胞杀伤模式,免疫治疗：基因测序后的下一个万亿市场,诺华开发的CART-19，已完成临床2期
6、试验。研报认为CART-19产品理论市场规模能够达到80-100亿美元。这仅仅是一家公司的产品所达到的市场规模，并不是整个行业的市场估值。国际上,诺华、罗氏、安进、默克、GSK等公司已进军细胞治疗行业。国内香雪制药 ，姚记扑克 ，冠昊生物等公司纷纷投资。,积极参与激烈竞争,美国小药企收购解放军总医院CAR-T疗法，中国金蛋为何砸到了美国？,2015年2月9日，美国生物制药公司Cellular Biomedicine (CBMG) 收购了中国解放军总医院(301医院)的CART细胞疗法，这项收购包括CD19、CD20、CD30、以及人表皮生长因子受体(EGFR)重组表达载体等免疫技术，已有的临床
7、I/II期结果、相关专利的所有权、以及生产技术。,CAR-T细胞治疗的优势,降低排异反应风险。使用患者自体细胞。治疗更精准。由于 CAR-T 细胞是应用基因修饰病人自体的 T 细胞，利用抗 原抗体结合的机制，能克服肿瘤细胞通过下调 MHC 分子表达以及降低抗原递呈等免疫逃逸，让肿瘤细胞无所逃遁。杀瘤范围更广。鉴于很多肿瘤细胞表达相同的肿瘤抗原，针对某一种肿瘤抗原的CAR基因构建一旦完成，便可以被广泛利用。多靶向更精准。CAR-T既可以利用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖脂类非蛋白质抗原，扩大了肿瘤抗原靶点范围，CAR-T细胞作用过程不受MHC的限制。杀瘤效果更持久。新一代 CAR 结构中加入了促进
8、T 细胞增殖与活化的基因序列，能保证 T 细胞进入体内后可以增殖，CAR-T 细胞具有免疫记忆功能，可以长期在体内存活。 低剂量。少量的细胞（ 1.510 5 个/公斤体重）的CAR-T可以是病情完全缓解。,CAR-T细胞治疗流程,载体的选择,质粒；转座子（睡美人系统）；mRNA；病毒（腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒，慢病毒等）,睡美人系统,睡美人转座子CAR-T 技术比病毒载体具有简便性, 价廉性和安全性。 和DNase高敏感位点。,睡美人转座子CAR-T 技术比病毒载体具有简便性, 价廉性和安全性，且高水平CAR基因表达 。,慢病毒载体,慢病毒载体（ Lentiviral vector,
9、LVs ）是在 HIV-1 病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效的将目的基因导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体能有效感染并整合到分裂和非分裂细胞中,感染效率高。慢病毒载体不表达任何 HIV-1 蛋白，免疫原性低，在注射部位无细胞免疫反应，体液免疫反应也较低，不影响病毒载体的第 2 次注射。,CAR-T治疗抗原的选择,血液系统恶性肿瘤中可选择的抗原,实体瘤中可选择的抗原,近期报道的CAR-T临床试验结果,2014年，报道携有CD137共刺激信号的CAR-T治疗30例急淋患者，完全缓解率90%（27人）；2014年，报道携有CD28共刺激信号的CAR-T治疗20例急淋患者，完全缓解率
10、60%（12人）；2015年，报道携有CD137共刺激信号的CAR-T治疗14例慢淋患者，反应率57%（8人）2015年，报道携有CD137共刺激信号的CAR-T治疗1例CD19阴性Multiple Myeloma患者，反应率100%（1人）,N Engl J Med 371(16): 1507-1517. Lancet 385(9967): 517-528.Sci Transl Med 7(303): 303ra139.N Engl J Med 2015; 373:1040-1047,Clinical Trials,China: EGFR，HER2，Mesothelin，GPC3，CEA，M
11、UC1Worldwide: EGFRvIII, EGFR, HER2, FRa, Mesothelin, NY-ESO-1, GD2, VEGFR-2,China is the second largest country which has 24 on-going clinical trials at present.Clinical trials have been ongoing in China since 2013 according to clinicaltrials.gov. search results.,本人构建用于301医院的CAR载体,CAR-CD20（淋巴瘤） Clin
12、icalTrials.gov Identifier: NCT01828008 CAR-CD19两种（白血病，淋巴瘤） ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01864889 CAR-CD33（甲状腺癌，白血病） ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01864902 CAR-CD138两种（骨髓瘤） ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01886976CAR-HER1(肺癌，胆管癌，胰腺癌等） ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01869166CAR-HER2（乳腺癌，
13、胃癌等） ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01935843,专利情况,一种工程化CD20，CD19（2个），CD33，CD138（2个），HER1，HER2靶向性的NKT细胞制备及应用。专利申请号：201410062069.7，201410425934.X，20140426383.9，201410425490.X，201410424674.4，201410426057.8，201410426060.X， 201410426077.5。,CAR-T细胞的制备,CAR-T基因的表达,M 阳参 NKT CAR-T H2O,750bp,100bp,2000bp,25
14、0bp,免疫荧光,CART-V5,Feb. 2013-Nov. 2015：119 cases were treated in 301 hospital,Objective clinical response：6/9 (66.7%),First report from China: CART 19 in B-ALL,First report: CART-20 in DLBCL,本研究结果首次报道了利用CART20治疗进展期DLBCL,国际上首次公开报道采用CART-33治疗难治性AML,CART138有效解决浆细胞白血病的问题,国际上首次公开报道采用CART-138治疗难治性MM,存在的问题,过
15、继性细胞治疗在显示出临床有效性的同时，也表现出一些临床副作用，如何控制这些不良反应，也是过继性细胞治疗所面临的挑战。细胞因子风暴。这是CAR-T 技术在临床应用中一个最主要的不良反应，由于T细胞的大量增殖引起的细胞因子释放，引起机体出现发热或发烧，肌痛，低血压，呼吸衰竭等症状。而针对 CAR-T 细胞回输引起的细胞因子风暴，临床上利用IL-6受体拮抗药物tocilizumab能够缓解。同时有研究小组也观察到细胞因子风暴也与疾病进展程度或者 肿瘤负荷有相关性，在高疾病负荷的患者体内，有较高的细胞因子释放。临床表现就是病人超高烧不退，如果不控制好，很有可能就救不过来了。这就是为什么说CAR-T的最
16、后一步是严密监护病人，这其实非常关键。,靶向细胞毒性。由于CAR-T抗原的靶向性非常强，无法区分表达相应抗原的肿瘤细胞和正常细胞，因此针对表达相应抗原的肿瘤细胞和正常细胞，都具有攻击 性。如针对CD19的CAR-T细胞治疗，导致B细胞发育不良，靶向Her-2的CAR-T细胞治疗以及靶向MAGE-A3的TCR-T，都能导致肿瘤部位以外的其他组织或器官遭受攻击，如心肺系统毒性。因此选择合适的肿瘤特异性抗原合成的CAR-T，在攻击肿瘤细胞的同时，能够区分正常细胞免受攻击。,神经系统毒性。几个研究组在用CAR-T治疗白血病的过程中，观察到少部分患者出现神经错乱，语言障碍，癫痫等神经系统不良反应。其他细
17、胞毒性。如有引起机体自免疫性疾病的风险。,未来工作重点：CAR-T的实体瘤治疗,CAR-T细胞疗法对白血病等血液肿瘤取得了巨大的突破，但是从针对实体瘤的临床试验结果看，CAR-T细胞对实体瘤的疗效并不显著。浸润能力不强，需增强CAR-T细胞归巢实体瘤的能力。需克服实体瘤内部微环境对免疫细胞功能的抑制。肿瘤干细胞。可能是癌症患者预后差和难以治愈的关键。安全性。防止脱靶效应。通用性。,肿瘤的免疫逃逸,EF1a,scFv,Hinge,TM,CD3,CD28,CD137,CD27,EF1a,scFv,Hinge,TM,CD3,CD28,CD137,EF1a,scFv,Hinge,TM,CD3,CD28
18、,EF1a,scFv,Hinge,TM,CD3,EF1a,scFv,Hinge,TM,CD3,CD28,CD137,CD27,EF1a,scFv,Hinge,TM,CD3,CD28,CD137,2A,Caspase9,2A,Caspase9,新CAR慢病毒载体的构建,EF1a,scFv,Hinge,TM,CD3,CD28,CD137,CD27,EF1a,scFv,Hinge,TM,CD3,CD28,CD137,2A,Caspase9,2A,Caspase9,IL-12,IL-12,PD-1,CTLA-4,TGF,CD20,CD19,ROR-1,CD133,CD123,CD44V6,HER2,H
19、ER1,CAR-T,截至2015年12月,工作整体进度,CD30,MESO,Lewis Y,NY-ESO-1,CEA,EpCAM,MUC-1,EGFRV,CAR-T,截至2015年12月,工作整体进度,TK-GCV自杀基因,其机制是干扰DNA合成，所以杀死细胞需要数天时间并且不完全， TK来源于病毒，有潜在的免疫原性。,iCasp9安全开关,防止脱靶效应,通用性,如何生产出通用型的CAR-T细胞以减少生产成本是极大的挑战。一个可能的方法是从捐献者身上获得T细胞后将细胞的HLA基因敲除,并表达非经典HLA分子,以阻止自然杀伤细胞介导的细胞识别和细胞溶解，从而生产出通用的T细胞产品。11月6日， Cellectis公司在GMP条件下，完成了通用性CAR-T疗法的3个生产批。该新闻直接导致巴黎交易所的Cellectis股票上涨20%。这充分强调工业化生产在接下来的肿瘤免疫竞争中发挥着重要作用。,以往的细胞疗法都属于自体移植范畴，而基于Talen 的基因编辑方法(转录激活因子样效应物核酸酶，是基因组编辑核酸酶三大类之一 )，使得细胞疗法的适用性得以扩展到一个人群，而不仅仅局限于单个个体，从而能够实现工业化大规模生产。“生产实现工业化使Cellectis公司有信心获得90%的毛利润。虽然异体CAR-T疗法的安全性和有效性还不太确定，但代表了未来细胞免疫治疗的发展方向。,谢谢！,
