1、2015年度,中山大学药学院 刘培庆 2015年12月15日,心血管药理讲座,从细胞因子及能量代谢角度研究慢性心力衰竭治疗的新靶点及干预策略,主要介绍内容,一、研究慢性心衰治疗新策略的必要性二、改善心肌能量代谢-治疗心衰的关键三、新策略及靶点：细胞因子、能量代谢与心力衰竭四、 TNF-及其受体心衰的治疗靶点及希望？五、抑制TNF-与 TNF-R1的结合活性的合成的优选多肽Pep3治疗心衰效果评价六、进一步研究思路,2,世界卫生组织08年10月发布了全球疾病状况的最新评估报告，心血管疾病是当前导致人类死亡的最主要原因。,一、研究慢性心衰治疗新策略的必要性,心血管疾病的主要死亡原因心力衰竭,发病率
2、高：国内患病率0.8%0.9%，患者约1200万, 而 且每年呈现50万递增的趋势； 预后差： 每年死亡20万，五年死亡率50； 费用大： 在欧美，治疗费用占整个卫生支出的2%，是肿瘤的2倍。,死亡,代偿期,失代偿期,恶化期,结构和功能的改变-重塑,高血压，冠心病遗传，心肌病瓣膜病，先心病,*,*,*,*,心力衰竭,心力衰竭的诱因和病理过程,4,研究背景,分子机制,跨膜信号传递,胞外刺激,基因表达活化,细胞形态、功能改变,CARDIAC HYPERTROPHY: The Good, the Bad, and the Ugly. Annu Rev Physiol, 2003.,激素、药物、神经递
3、质,膜受体,第二信使 Ca2+,离子通道,活性肽,心力衰竭,心律失常,线粒体活性氧,心脏病相关基因,活性肽,(1),(1),心力衰竭,心力衰竭可能的发展基础,7,First Step,Ref: Webster,MD,PhD:Acne . Dermatol 1996,8:237-268,慢性心衰治疗理念的进步,70年代：改善血流动力学紊乱：强心、利尿、扩血管,任何减少能量消耗的心力衰竭疗法，如受体阻滞剂，ACEI，ARB均可以改善心衰患者的预后。增加能量消耗的药物，如正性肌力药物，则增加心衰的死亡率。,Neubauer S. N Engl J Med, 2007, 356:1140-1151.,
4、二、改善心肌能量代谢-治疗心衰的关键,调节心肌能量代谢有望成为治疗心衰的新策略,心脏耗能位居所有器官之首，每天消耗6kg ATP，搏动约 10 万次，向全身泵出 10 吨血液。心脏通过能量代谢将储存于脂肪酸或葡萄糖中的化学能转化为机械能，为心脏收缩和舒张提供能量。若能量产生和利用的效率发生改变，心脏便会出现功能障碍。,心脏的能量代谢,2、糖酵解（极少）,正常心肌的能量代谢,ATP来源,正常心肌的能量代谢,正常心肌的能量代谢过程（一）：底物的利用,丙酮酸,葡萄糖,脂肪酸,糖酵解,脂酰CoA合成酶,乙酰CoA,丙酮酸脱氢酶（PDH）,有氧状态,脂酰CoA,脂酰CoA,-氧化,三羧酸循环,CO2 +
5、 NADH,Mitochondria,cytoplasm,Blood,肉毒脂酰转移酶（CPT）,正常心肌的能量代谢过程（二）：氧化磷酸化,线粒体外膜,线粒体内膜,Q,H+,H+,H+,O2,H2O,H+,ATP合酶,ADP + Pi,ATP,NADHH,NAD,FADH2,FAD,三羧酸循环,游离脂肪酸氧化,Mitochondria,2004年，Van Bilsen 等提出心肌代谢重构的概念。,Van Bilsen M, et al. Cardiovasc Res, 2004, 61: 218-226,心肌代谢重构（metabolic remodeling）,由心肌细胞糖类和脂肪等物质代谢紊乱
6、引起心脏能量代谢途径改变，导致细胞结构和功能异常的现象。,脂肪酸氧化作用受损，主要的心肌能量来源从脂肪酸氧化变为糖酵解。重构过程至失代偿状态，心肌能量缺乏。,Razeghi P, et al. Circulation, 2001, 102: 2923-2931. Paolisso G, et al. Metabolism, 1994, 43: 174179.,衰竭心肌的能量代谢,FFA氧化率正常或增加，葡萄糖摄取和糖酵解可能加速， 心肌细胞处于代偿状态。,心衰早期,心衰晚期,脂肪酸氧化受损可能继发于线粒体结构紊乱。PDH和CPT-1活性改变脂肪酸氧化的基因表达下调,Bilsen MV. Car
7、diovasular Res. 2009, 81:420-428,衰竭心肌的能量代谢,ATP产生减少，心肌收缩、舒张功能障碍,Ide T, et al. Circ Res, 2001, 88:529-35.Quigley AF, et al. J Card Fail, 2000, 6:47-55.Casademont J, et al. Heart Fail Rev, 2002;7:131-9.,衰竭心肌的能量代谢,线粒体内膜ANT蛋白表达下降,cytoplasm,ATP,ADP +,线粒体肌酸激酶,+ 肌酸（Cr）,磷酸肌酸（PCr）,衰竭心肌的能量代谢,PPAR调节心肌线粒体功能及脂肪酸氧
8、化的重要核转录因子。PPAR基因敲除鼠心肌脂肪酸氧化明显降低，而转基因鼠心肌脂肪酸氧化增强。研究发现，心衰患者心肌组织PPAR的表达较正常心肌组织下降54，PPAR受损可能导致心肌能量匮乏。,Karbowska J, et al. Cell Mol Biol Lett, 2003, 8:49-53,衰竭心肌能量代谢的基因调节,重要的核受体转录因子-PPAR ,外源性配体（调脂药）,内源性配体（长链脂肪酸）,PPAR,PPRE,脂肪酸氧化（FAO）基因,CD36/FATFABPFACSmCPT-1MCAD, LCADUCP3,细胞核,PPAR,衰竭心肌能量代谢的基因调节,Stanley WC.
9、Physiol Rev. 2005, 85:1093-1129,重要的核转录共活化因子PGC-1,衰竭心肌能量代谢的基因调节,可与PPAR等多种核转录因子结合,Zhou SG, Liu PQ*（刘培庆，通讯作者）.Proteomic Analysis of Hypertension-Induced Left Ventricular Hypertrophy by Two-Dimensional Difference Gel Electrophoresis and Mass Spectrometry J Proteome Res, 2006,5(11):2901-2908 (IF 6.92),23
10、, SHR与2k2c RHR心肌肥大大鼠心肌组织蛋白组学研究,发现了18个差异表达蛋白，其中12个是能量代谢密切的酶，如-烯醇化酶、短链脂酰辅酶A 脱氢酶、NADH 脱氢酶亚复合体10、谷胱甘肽-s-转移酶等,研究基础,研究了NAD合成的限速酶在心肌肥大中点变化及调控机制Nmnat2 protects cardiomyocytes from hypertrophy via activation of SIRT6.Nmnat3 protects cardiomyocytes from hypertrophy via activation of SIRT3.,NAD+的生物合成,尼克酰胺磷酸核糖基
11、转移酶（Nampt）和烟酰胺单核苷酸腺苷酰基转移酶（Nmnat）对NAD+的合成起到了关键的催化作用。,NAD+的转运及细胞分布,NAD+主要存在三个不同的细胞池：1）细胞质池，2）线粒体池和3）细胞核池。,Cai Y, Liu PQ * (刘培庆，通讯作者). Nmnat2 protects cardiomyocytes from hypertrophy via activation of SIRT6. FEBS Lett. 2012 ;586(6):866-74,27,证明了PPAR、NFATc4及 GATA-4之间相互作用在心肌肥大中的意义,证明了PPAR、NFATc4及 GATA-4之
12、间相互作用在心肌肥大中的意义。,29,Le K, Liu P* (刘培庆，通讯作者). PPAR activation inhibits endothelin-1-induced cardiomyocytehypertrophy by prevention of NFATc4 binding to GATA-4. Arch Biochem Biophys. 2012 ;518(1):71-8,30,心衰过程中转录调控因子PGC-1、 RIP140 表达与能量代谢关键指标的关系,31,Chen Y, Liu P * (刘培庆，通讯作者). Roles of transcriptional cor
13、epressor RIP140 and coactivator PGC-1 in energy state of chronically infarcted rat hearts and mitochondrial function of cardiomyocytes. Mol Cell Endocrinol. 2012 ;362(1-2):11-8,PGC-1、 RIP140 的转录调节涉及到多个能量代谢相关基因,32,增加线粒体生物合成,NRF(核呼吸因子)PGC-1-PPAR,线粒体生物合成,。,此二者是调控心肌脂肪酸分解和线粒体供能的枢纽,心肌代谢疗法底物的调节,Jennifer G.
14、 Duncan and Brian N. Finck,The PPAR-PGC-1 Axis Controls Cardiac Energy Metabolism inHealthy and Diseased Myocardium,PPAR Research, 2008,心肌代谢的争议与思考,脂肪酸,心肌肥厚和心衰时，能量代谢底物改变何种程度是代偿性的，何种程度是失代偿性的？脂肪酸氧化抑制在何时？抑制到什么程度?可以改善心衰。心衰时葡萄糖代谢可以代偿脂肪酸氧化降低的能量不足吗？心衰 心肌代谢 心衰,代谢重构在心衰治疗中的意义,拮抗神经体液：血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI) 、血管紧张素受体拮
15、抗剂、-受体阻滞剂心衰缺能底物的调节： 1）增加葡萄糖氧化：曲美他嗪（Trimetazidine,TMZ) 2）抑制脂肪酸氧化：L-卡尼丁(L-carnitine) 3）增强呼吸链功能：辅酶Q10 4）补充磷酸肌酸 5）Potential therapy: promote mitochondria biogenesis,三.新策略及靶点细胞因子受体、能量代谢调控？,心衰过程中增高的细胞因子、神经激素及生长因子形成网络，其错综复杂的网络调节紊乱决定了心衰病理过程的复杂性，针对某一靶点或单一环节的药物往往难以起到理想的治疗心衰效果。靶向细胞因子受体及心肌能量代谢关键环节的药物具有重要的研发前景，心
16、衰新靶点的干预正在成为治疗心衰的希望。,37,Ardehali H, et al. Eur J Heart Fail. 2012 ;14(2):120-9.,经典的神经-体液因素,肾素血管紧张素醛固酮系统交感神经系统内皮素系统 胰岛素抵抗细胞因子和生长因子,血管平滑肌细胞,免疫细胞,肥大凋亡舒缩,增殖胶原的合成和分泌合成细胞因子调控心肌细胞,血管生成炎症反应调节心脏微循环,炎症反应,细胞因子网络与炎症反应通路,引自:Sun SC. The noncanonical NF-B pathway. Immunol Rev. 2012, 246(1):125-40,40,TNF-及其受体炎症性疾病重要
17、治疗靶点！,TNF-是诸多炎性相关疾病细胞因子网络的关键部分，也是与能量代谢障碍密切相关的细胞因子， TNF-主要通过 TNFR1介导胞内信息传递及细胞功能改变，是炎症性疾病重要治疗靶点。,41,Chen G, Goeddel DV. TNF-R1 signaling: a beautiful pathway. Science. 2002，296:1634,以TNF-孵育AC16（人源性心肌细胞株） 或H9c2细胞（心肌细胞株），可以明显下调丙酮酸脱氢酶激酶4、 PGC-1、肉碱脂酰基转移酶(CPT-) ，诱导葡萄糖氧化率显着增加，同时增加MCP-1及IL-6表达增加，该作用主要通过NFB及P
18、38信号通路。 心脏特异性过表达TNF- 小鼠 (Mus musculus)也表现出明显的PGC-1表达下调。,Gao F, et al. J Cardiovasc Pharmacol.2012;59(6):500-6Palomer X et al. Cardiovasc Res 2009;81:703-712,四、TNF-及其受体心衰的治疗靶点及希望？,（一）TNF-与心肌能量代谢,Schematic representation of the mechanisms involved in the metabolic dysregulation of AC16 cells treated w
19、ith tumour necrosis factor-.,Palomer X et al. Cardiovasc Res 2009;81:703-712,Published on behalf of the European Society of Cardiology. All rights reserved. The Author 2008. For permissions please email: journals.permissionsoxfordjournals.org,Palomer X et al. Cardiovasc Res 2009;81:703-712,PGC-1 dow
20、nregulation by tumour necrosis factor- involves both nuclear factor-B and p38 mitogen-activated protein kinase activation.,Palomer X et al. Cardiovasc Res 2009;81:703-712,Published on behalf of the European Society of Cardiology. All rights reserved. The Author 2008. For permissions please email: jo
21、urnals.permissionsoxfordjournals.org,PGC-1 downregulation by tumour necrosis factor- dysregulates metabolism.,Palomer X et al. Cardiovasc Res 2009;81:703-712,Published on behalf of the European Society of Cardiology. All rights reserved. The Author 2008. For permissions please email: journals.permis
22、sionsoxfordjournals.org,（二）TNF-及其受体心衰的治疗靶点及希望？,普遍支持慢性心衰患者循环血中 TNF-水平显著增高，且增高的程度与CHF的严重程度、心功能分级及死亡率呈正相关。不同病因间（高血压、冠心病、风湿性心脏病、扩张型心肌病）所导致的心力衰竭循环中TNF-的含量无明显统计学差异，提示循环血中TNF-增高参与心衰的基本病理过程。Levine B, et al. N Engl J Med. 1990; 323(4):236-41.Kosar F, et al. Eur J Heart Fail. 2006; 8(3):270-4.Sharma R, et al.
23、 Am J Cardiol. 2003;15;92(2):188-93.,48,1、临床研究资料,2.实验动物水平研究,1. 转TNF-基因小鼠出现心衰表现，提示TNF-与心衰的密切关系2. TNF基因敲除 (TNF-/-)小鼠对腹主动脉缩窄介导的心脏重构、炎症反应等均比C57背景鼠轻得多，而且心功能也明显改善3.灌注TNF-可导致大鼠心肌收缩性明显下降以及心室过度舒张。4. 心衰时心脏既是TNF-作用的靶器官，也是其生物合成的场所。TNF-的表达水平与心衰的严重性相关，心肌表达TNF-受体。 Shusterman V, et al. Am J Physiol Heart Circ Physi
24、ol. 2010; 298(2):H440-50 Jobe LJ, et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2009;297(4):H1462-8； Sun M, et al. Circulation. 2007;115(11):1398-407.,49,3. 靶向TNF-途径治疗心衰现状,已上市的TNF-抑制剂：依那西普（Etanercept）、英利昔单抗（Infliximab）和阿达木单抗（Adalimumab）等大分子蛋白药物。其机制为竞争性和TNF-结合，阻断TNF-和细胞表面TNF受体结合，降低TNF-活性，为非选择性拮抗TNF-作用。其临床适
25、应症主要为类风湿性关节炎等，以往缺乏单纯治疗心衰治疗的大样本临床资料。Nurmoham等近期对10.9万RA患者（其中4.8万例暴露于抗TNF治疗)的大样本回顾性研究明确：抗TNF治疗与未用TNF治疗相比显著减少包括心衰在内的多种CV事件发生的风险。 Nurmoham,et al. Ann Rheum Dis 2012;71(Suppl3):52 。,50,（三）研究TNFR1亚型及胞外区的意义,TNF受体:目前发现的有TNFR1和TNFR2，两种都为跨膜蛋白。 TNFR1及TNFR2胞外区有30%同源性，胞内区无同源性，提示二者介导不同的信号转导机制, TNFR1 是TNF- 引发炎症反应的
26、主要受体，也是心衰过程中心脏的主要表达受体。 TNFR2不能直接激活胞内信号通路,亦有研究认为激活TNFR2有助于心衰治疗。利用高选择性多肽或选择性小分子抑制剂区分TNFR1不同胞外TNF- 结合区，分别研究TNFR1不同胞外区介导的相关的胞内信号机制，有望发现适合治疗心衰新的靶点、信号途径及相关靶基因。,51,Chen G, Goeddel DV. TNF-R1 signaling: a beautiful pathway. Science. 2002;296(5573):1634-5,TNF受体途径 1）TNF与TNFR1胞外区结合，使TNFR1形成三聚体。 2）三聚体TNFR1通过其聚集
27、的胞内区死亡结构域（DD）招募下游信号传导蛋白（TRADD、FADD、TRAF2、RIP）。 3）下游信号传导蛋白形成复合体，激活下游的caspase 8以及各种效应分子caspases，产生级联激活反应，最终引起靶细胞凋亡。 4）TNF还可通过下游激活蛋白RIP，TRAF2等，分别激活NIK和MEKK，从而激活NFKB和cJun，抑制细胞凋亡。,TNFR1主要通过第2、3 功能区（CRD2,CRD3)与TNF-相互识别， TNF- 与TNFR1 的识别的两个关键位点分别位于CRD2 和CRD3 的A1 模块,关键的作用位点存在于A1 模块的疏水区,目前对于TNFR1的研究及TNFR1抑制剂的
28、设计和开发主要集中在这2个功能区，特别是针对CRD3已研究出选择性及抗炎效价较高的环肽抑制剂（YCWSQYLCY, C-C），但并没有进行治疗心衰效果评价。 Takasaki W,et al. Nat Biotechnol 1997; 15:1266-70Mukai Y, et al. J Mol Biol 2009; 385:1221-9,53,BMC Struct Biol. 2012 , 12: 8,54,CRD4亦有非常保守的A1 模块结构，针对于CRD4 A1 模块结构疏水区域的作用研究对于客观认识TNF- 和TNFR1的结合模式我们以 TNF-R1 的胞外CRD4 区的A1 模块疏
29、水区为模板，设计合成TNFR1 衍生小肽序列，并对其进行活性测试，筛选出对TNF- CRD4 区有较高亲和力，可以通过对TNF-的识别及阻断作用抑制TNF- 信号传导较高活性肽Pep3，动物实验显示出比Etanercept更好的治疗心衰效果，申请并已获得专利授权。Cao Y, Liu P*. A synthetic peptide derived from A1 module in CRD4 of human TNF receptor-1 inhibits binding and proinflammatory effect of human TNF-alpha, Inflammation,
30、2009, 32: 139-145一种多肽及其在制备抗心衰和炎性反应药物中的应用，中国发明专利授权号：ZL 2008 10218732.2；发明(设计)人：刘培庆; 蒋建敏; 曹颖男,四.针对TNF-及其受体TNFR1的研究,我们利用心梗致心衰大鼠模型比较了Etanercept和我们前期筛选到的TNFR1 CRD4区抑制剂Pep3，发现尽管Etanercept 抑制TNF-活性作用高于Pep3，但改善心脏功能作用不及Pep3。TNFR1可与TNF-结合的胞外端包括CRD3区和CRD4区，是否TNF-与TNFR1 CRD3区、CRD4区结合介导的胞内信号机制、靶基因及转录调控不同？针对TNF-受
31、体及亚型的选择性抑制更有利于心衰治疗？,(一）建立了针对TNFR1 CRD4区多肽合成、多肽表征鉴定及活性筛选体系1. 肽库的设计及多肽合成以I型TNF受体（TNFR1）N端胞外第四区域（Domain 4）的天然结构为目标，应用组合化学、多肽固相合成技术，结合现代合成、分离纯化技术，建立各种不同的多肽衍生物，通过各种波谱分析及HPLC等确定它们的结构纯度。小分子肽的合成采用固相Fmoc法，选用2-Chlorotrityl chloride树脂作为固相载体，N,N-二甲基甲酰胺做溶剂，缩合试剂选用二异丙基碳二亚胺，使用Reagent B切除肽链和侧链保护基，有关合成技术已经完善。,57,图1.
32、固相Fmoc法合成肽链示意图,58,2. 建立了合成多肽分子量的ESI- MS质谱表征分析、多肽纯度的HPLC表征分析、合成的粗产品HPLC纯化方法及活性分析TNF- binding实验方法,Fig. 2. HPLC analysis of Pep 3 at 254 nm and 214 nm.,Fig.3. ESI-MS analysis of Pep 3,59,3. 证明了已合成的优选多肽Pep3具有较高的抑制TNF-与 TNF-R1的结合活性、抑制HeLa细胞IB-降解及NF-B p65核转位。,Fig. 4. Inhibition of TNF- binding to TNF-R1 b
33、y synthetic peptides in ELISA.,Fig. 5. Effect of Pep 3 on TNF-induced degradation of IB- in HeLa cells.,Fig. 6. Effect of Pep 3 on TNF-induced NF-B p65 subunit nuclear translocation.,Cao, Y, Liu, P * (刘培庆，通讯作者). A synthetic peptide derived from A1 module in CRD4 of human TNF receptor-1 inhibits bind
34、ing and proinflammatory effect of human TNF-alpha, Inflammation, 2009, 32: 139-145,60,Yu S, Liu P.* (刘培庆，通讯作者).Sirtuin 6 protects cardiomyocytes from hypertrophy in vitro via inhibition of NF-kappaB-dependent transcriptional activity, Br J Pharmacol, 2012. DOI: 10.1111/j.1476-5381.2012.01903.x,发现Sir
35、t6通过以酶活性依赖性方式抑制NF-B的转录激活发挥抑制心肌肥大及炎性反应的作用,61,建立了巨噬细胞炎症反应模型，为从炎性病变角度研究心衰提供了技术支持。,Xu S, Liu PQ*（刘培庆，通讯作者）. Tanshinone II-A inhibits oxidized LDL-induced LOX-1 expression in macrophages by reducing intracellular superoxide radical generation and NF-B activation. Transl Res. 2012 Aug;160(2):114-24,毕业论文扫描
36、封面,63,鉴于TNF-在心衰过程中的重要作用，TNF-及其受体TNFR1有望成为心衰治疗的新途径及新靶点！,六、进一步研究思路,通过多肽设计、合成及优化, 获得更高活性及选择性多肽研究TNF-通过TNFR1胞外不同区域介导心衰能量代谢紊乱的机制明确干预TNF-信号途径治疗心衰可行性，确定具体干预靶点对研发的高活性高选择性多肽进行治疗心衰的药效学评价，为进一步小分子化合物的设计及研发奠定良好的基础。,65,短肽库,TNR1活性测试（试剂盒）,有机合成,靶标 （ TNFR1 ）,专利多肽Pep3,构效关系分析,优选多肽Pepx,合理化设计,结构优化,细胞活性测试（IC50）,小分子抑制剂,合理化
37、设计,1. 多肽设计、合成及优化,TNF Receptor 1、TNF和小分子抑制剂的模建作用模式,基于晶体结构：1FT4 和 1TNR,67,TNF小分子抑制剂的发现（设计、合成和活性测试）,目标化合物,结构改造,有机合成,活性测试,先导化合物,68,中国天然产物数据库（CNPD ）,(A) Chemical structure of the small molecule TNF- inhibitor. See (12) for synthetic route used. (B) Compound inhibition of TNF- binding to TNFR1 in vitro. A
38、n ELISA (12) was used to measure inhibition of solution-phase TNF-R1 horseradish peroxidase conjugate binding to biotinylated TNF- immobilized on a strepavidin-coated microtiter plate by serial dilutions of compound. The solid line represents a four-parameter curve fit (20) that yielded an IC50 valu
39、e of 22 M. (C) Compound inhibition of TNF- induced IB- depletion in HeLa cells. Cells were treated with sufficient TNF- or IL-1 to give an 80% of maximal IB- depletion response after a 30-min exposure (0.4 and 0.04 ng/ml, respectively), as measured in an assay of cell lysates (12). Solid circles sho
40、w that compound addition inhibits this TNF-induced IB- depletion and yields an IC50 value of 4.6 M. Open circles show that compound addition does not affect orthogonal IL-1induced IB- depletion. Error bars indicate standard deviations for triplicate measurements.,二甲基胺为隔离基相联结的三氟甲基苯基吲哚和二甲基色酮能够抑制TNF-和它
41、的受体之间的链接。抑制TNF-与TNFR1结合 IC50为22mol/L，而抑制TNF- 诱导的 IB-解离IC50 为4.6mol/L。,2. 正在进行TNF小分子抑制剂的研发工作,通过与本院“结构生物学与药物设计实验室”罗海彬教授课题组合作，以靶蛋白及其受体的复合晶体结构为模板，进行“TNF Receptor 1、TNF和小分子抑制剂的模建作用模式及TNF小分子抑制剂的设计、合成和活性测试”。双方已有良好合作基础，共同发表文章如下，为靶向TNF及其受体的小分子抑制剂研发奠定了良好基础。 Liu M, He L, Hu X, Liu P, Luo HB. 3D-QSAR, homology
42、modeling, and molecular docking studies on spiropiperidines analogues as agonists of nociceptin/orphanin FQ receptor. Bioorg Med Chem Lett. 2010; 20(23): 7004-7010Chen SK, Zhao P, Shao YX, Li Z, Zhang C, Liu P, Luo HB, Hu X. Moracin M from Morus alba L. is a natural phosphodiesterase-4 inhibitor. Bi
43、oorg Med Chem Lett. 2012;22(9):3261-3264.Shao YX, Zhao P, Li Z, Liu M, Liu P, Luo HB. The molecular basis for the inhibition of human cytochrome P450 1A2 by oroxylin and wogonin. Eur Biophys J. 2012;41(3):297-306.,70,(A) X-ray crystallography structure of the TNF- dimercompound complex. (B) Shift in
44、 subunit orientation within the TNF- dimercompound complex. Superposition of the TNF- trimer structure (gray) with the TNF- dimercompound complex structure (yellow-blue) shows a slight widening in the angle between the subunits at the compound binding site. (C) View of compound binding site on the T
45、NF- dimer. Image shows the 2Fo Fc electron density omit map of the compound (contoured to 1) calculated from phases derived from refinement of the structure without compound (mesh). The binding pocket can be seen to comprise residues from both chain A (yellow) and chain B (blue). (D) sheet secondary
46、 structure around the compound binding site and the location of six tyrosine residues that contact the compound. The tyrosines are colored-coded with Tyr59 (tan), Tyr151 (purple), and Tyr119 (blue) residues being presented from both chain A and chain B.,具有TFN-的化合物的X射线晶体结构测定表明抑制剂取代了蛋白质的3个亚单元并与TNF-亚单元
47、二聚体形成配合物。研究者认为,在研究因蛋白质解离而使复杂蛋白质失活的小分子抑制剂时,这个结果将有助于鉴定用试样的设计。,总 结,我们用蛋白差异表达技术研究了SHR与2k2c RHR心肌肥大大鼠心肌组织蛋白组学，发现了18个差异表达蛋白，其中12个是能量代谢密切的酶, 为心肌肥大及心衰的能量代谢异常学说提供了重要依据。建立了慢性心衰能量代谢相关的信号通路、基因及线粒体功能、核转录调控、表观遗传等分析方法，证明了能量代谢异常在心肌肥大及心衰病理过程中的重要性研究了NAD合成的限速酶在心肌肥大中点变化及调控机制发现型组蛋白去乙酰化酶（Sirt）通过以酶活性依赖性方式抑制NF-B的转录激活发挥抑制心肌肥大作用，为心肌肥大的炎性反应及心衰的表观遗传调控提供了 依据对心肌肥大及心衰病理过程中细胞内信号分子的相互作用及网络联系进行了系统研究，特别是核受体及转录因子的调控分析，证明了PPAR、NFATc4及 GATA-4之间相互作用。建立了巨噬细胞炎症反应模型，证明了中药单体丹参酮A主要通过抑制细胞内NF-B的转录激活发挥抑制炎症反应作用，为从炎性病变角度研究心衰提供了技术支持,谢 谢！,欢迎各位专家多提宝贵意见！,主 要 内 容,正常心肌能量代谢,正常心肌的能量代谢过程（三）：ATP的转移和利用,心脏收缩,肌酸激酶能量穿梭机 制,Mitochondria,cytoplasm,
