1、细胞生物学实验 实验 4 2015/4/13实验 4 细胞骨架的显示及观察姓名：李思露学号：131140040一、 实验目的1. 掌握用考马斯亮蓝 R250 染色观察动物和植物细胞骨架的原理和方法。2. 了解免疫荧光法检测细胞成分的原理和方法。二、 实验原理1. 细胞骨架：指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。狭义的细胞骨架是指细胞质骨架，包括微管（microtubule，MT） 、微丝（microfilament，MF） 、中间纤维（intermediated filament，IF） 。 2. 微管微管是细胞内由微管蛋白形成的直径
2、约2026nm 的长度不一的小管。分布在核周围，呈放射状向胞质四周扩散，主要确定膜性细胞器的位置和作为膜泡运输的导管。微管蛋白有 和 两种。 异二聚体沿纵向聚合成丝，原丝成环状排列形成微管的壁。微管不稳定，对低温（冷冻） 、高压等物理因素及秋水仙素（微管断裂剂）等化学因素敏感。紫杉醇可以和微管蛋白多聚体结合，抑制微管解聚。3. 微丝：真核细胞内是主要由肌动蛋白（actin）组成的直径为 57nm 的骨架纤丝。主要分布在细胞质膜的内侧，作用是确定细胞表面特征、并与细胞运动、收缩、内吞等功能有关。脊椎动物肌动蛋白分为 、 和 三种类型，不同种类细胞中肌动蛋白组成不同。肌动蛋白单体为球形，依次连接成
3、链，两串肌动蛋白链互相缠绕扭曲成一股微丝。细胞松弛素 B 为微丝断裂剂。4. 中间纤维：直径介于微丝和微管之间（711nm） 、由多种不同蛋白组成的细胞骨架细胞生物学实验 实验 4 2015/4/13成分。在细胞中围绕着细胞核分布，成束成网，并扩展到细胞质膜，与质膜骨架相连结。主要起机械支撑和加固作用。组成中间纤维的蛋白：角蛋白，波形蛋白，结蛋白、神经纤维，神经胶质纤维和核纤层蛋白。不同组织来源的细胞，组成其中间纤维的蛋白质种类可能不同。5. 研究细胞骨架的意义。（1）了解细胞骨架与细胞各种功能行使之间的关系。（2）了解理化因素是否通过影响细胞骨架对细胞功能产生影响，以便趋利避害。（3）鉴定发
4、育中的细胞及肿瘤的来源。6. 显示细胞骨架的常用方法：考马氏亮蓝染色法、免疫荧光染色法、鬼笔环肽标记法。（1）考马斯亮蓝染色法原理及特点原理：用去垢剂 Triton X-100 处理细胞适宜时间，可以溶解膜脂，并与大部分非骨架蛋白疏水区结合而将其溶解，剩下的纤维状细胞骨架蛋白比较稳定而不被溶解，然后用蛋白染料考马斯亮蓝染色即可显示其结构。特点：非特异蛋白染色，不能区分微管、微丝、中间纤维（2）免疫荧光染色法原理及特点原理：用 TritonX-100 处理固定处理过的细胞，可增加细胞膜通透性，使抗体能够进入细胞内与细胞骨架蛋白结合。接着用荧光素标记的抗骨架蛋白抗体便可通过直接免疫荧光法或间接免疫
5、荧光法显示骨架。特点：特异显示各种骨架蛋白（3）鬼笔环肽标记法原理及特点原理：鬼笔环肽可特异性地结合肌动蛋白，因此，用荧光素标记的鬼笔环肽可以显示微丝。特点：灵敏，能特异显示微丝。三、 实验材料、试剂及用品（一） 材料： 洋葱（二） 试剂（1）M-缓冲液。（2）6mM 磷酸盐缓冲液（pH6.8） 。（3）含 1%TritonX-100 的 M-缓冲液。细胞生物学实验 实验 4 2015/4/13（4）用 M-缓冲液配制的 3.0%戊二醛。（5）0.2%考马斯亮蓝 R250 染液。（6）0.9%氯化钠生理盐水。（三） 用品普通光学显微镜、荧光显微镜、水浴箱（ 37 ）小剪刀、镊子、5mL 一次性
6、塑料注射器、胶头吸管、1.5mLEP 管、1.5mL 试管架四、 实验操作考马斯亮蓝染色法显示洋葱鳞茎内表皮细胞骨架（1） 材料准备：撕取洋葱鳞茎内表皮，裁成大小 0.5cm.的小片。（2） PBS 平衡：放入盛有 1mL 6mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH6.8）的 EP 管中，静置使材料下沉（完全浸透） ；然后用胶头滴管吸弃液体。（3） TritonX-100 处理：加 1mL 1% TritonX-100 溶液处理 20min，然后用胶头滴管吸弃液体。（4） 洗涤：用 M-缓冲液洗涤 3 次，每次加 1.5mL 溶液浸泡 5min，然后用胶头滴管吸弃液体。（5） 固定：加 1mL 3.0
7、%戊二醛固定 30min,然后用胶头滴管吸弃液体。（6） 洗涤：用 PBS 洗涤 3 次，每次浸泡 5min,然后用胶头滴管吸弃液体。（7） 染色：用 0.51.0mL 0.2%考马斯蓝 R250 染液染色 10min。（8） 洗涤：用蒸馏水洗涤数遍。（9） 制备装片：给载玻片中央加 1 滴水，用镊子夹取样品在其中展开，然后加盖玻片。（10） 显微观察：在普通光学显微镜下，洋葱细胞骨架为布满细胞的蓝色网状结构。（11） 对照样品：省去步骤（3） ，不用 TritonX-100 处理；省去步骤（4）,用TritonX-100 处理后不用 M-缓冲液洗涤。五、 实验结果及结论1.实验样品图 1 洋
8、葱鳞茎内表皮细胞骨架（400 倍）实验样品的细胞骨架分布细密均匀，视野中只剩下细胞骨架的蛋白质，被考马斯亮蓝染成蓝色。在视野的上半部分，细胞的背景呈现蓝紫色，是由于最后洗涤不彻底所致。细胞生物学实验 实验 4 2015/4/132.对照样品：不用 TritonX-100 处理图 2 不用 TritonX-100 处理的洋葱鳞茎内表皮细胞骨架（400 倍）不用 TritonX-100 处理的对照样品的细胞中除了细胞骨架还有很多膜泡结构，细胞中还有蓝色的细胞核。不用 TritonX-100 处理，使得视野中有很多非骨架蛋白，这些非骨架蛋白被考马斯亮蓝染成蓝色，影响对细胞骨架的观察。3.对照样品：用
9、 TritonX-100 处理后不用 M-缓冲液洗涤图 3 用 TritonX-100 处理后不用 M-缓冲液洗涤的洋葱鳞茎内表皮细胞骨架（400 倍）图 3 和图 2 的情况类似，视野中没有均匀细密的细胞骨架，这是由于 M-缓冲液使细胞骨架中的微丝保持稳定。在 M 缓冲液中，其中咪唑是缓冲剂，EGTA 和 EDTA 螯合钙离子，溶液并提供镁离子，在低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张，便于观察。用 TritonX-100 处理后虽然可以溶解膜脂和非细胞骨架蛋白，但是保留下来的骨架蛋白在没有 M-缓冲液的作用下，其结构仍无法保持稳定，影响观察结果。六、 作业与思考题1. 比较用与不用
10、1%TritonX-100 处理的实验结果。答：见五、实验结果与结论部分 1、2。2 查阅资料说明 M-缓冲液中咪唑、MgCl 2、EGTA、EDTA、巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）在稳定细胞骨架中的作用。 答：在 M-缓冲液中，咪唑是缓冲剂，MgCl 2提供 Mg2+,EGTA 和 EDTA 螯合 Ca2+，在低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张，便于观察；巯基乙醇或二硫苏糖细胞生物学实验 实验 4 2015/4/13醇（DTT）可以在二硫键被打开后使蛋白质的四级或三级结构被破坏，由于巯基乙醇能够打开蛋白质的结构，它常常被用于蛋白质分析，且巯基乙醇也常常被用于保护蛋白质中自由的半胱氨
11、酸巯基之间不会错误形成二硫键。3. 设计检测微丝的间接免疫荧光法实验流程。（1） 用未标记的微丝抗体加到微丝抗原标本上，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。（2） 加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗 IgG、IgM 抗体，标记的抗球蛋白抗体和已结合抗原的抗体进一步结合。（3） 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（+）荧光明亮；（+ -+）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“+”以上，而各种对照显示为（）或（-） ，即可判定为阳性七、反思与改进1. 防止洋葱鳞茎内表皮卷曲、折叠，若卷曲折叠可以在洗涤的过程中慢慢展开，没还展开，在制片时用镊子小心的将内表皮展开。2TritonX-100 处理时间应足够，处理完洗涤应充分，否则胞内会存在膜泡状结构及其它杂蛋白，干扰骨架染色及观察，尽量保证各组各步处理的时间和方法一致。3. TritonX-100 处理后各步操作应轻柔，避免容器剧烈震荡及吸管吹打过猛引起骨架蛋白束断裂。
