1、实验十一 血清 ALT 测定（赖氏法）【目的】1.了解血清 ALT 活性测定的原理及测定方法。2.掌握血清 ALT 活性测定的临床意义。【原理】丙氨酸与 -酮戊二酸在丙氨酸氨基转移酶（ALT）的作用下生成丙酮酸和谷氨酸。在反应到达规定时间时，加入 2，4-二硝基苯肼-盐酸溶液以终止反应。生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸 2，4-二硝基苯腙。后者在碱性条件下显棕红色。根据颜色的深浅，求得血清中丙氨酸氨基转移酶的活力。反应式如下：COHCHCH3NH2COHCOCH2CH2COH ALT CH3CCOHOCOHCHNH2CH2CH2COH- COHCCH3O CH3CCOHN NO
2、2NO2NHNO2NO2NHNH224- -24-NaOH-H2O【器材】试管、刻度吸管、恒温水浴箱、分光光度计。【试剂】1. 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4） 称取磷酸氢二钠(Na 2HPO4，AR)11.928g，磷酸二氢钾(KH 2PO4，AR)2.176g，加少量蒸馏水溶解并稀释至 1 000ml。2.ALT 底物液 称取 -酮戊二酸 29.2mg，DL 丙氨酸 1.79g 于烧瓶中，加 0.1mol/L pH7.4 磷酸盐缓冲液 80ml,煮沸溶解后冷却，用 1mol/L NaOH 调节 pH 至 7.4（约加入0.5ml） ，再用 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液在容量瓶
3、内加至 100ml，混匀，加氯仿数滴，置冰箱可保存数周。3.丙酮酸标准液（2mol/ml） 精确称取丙酮酸钠(AR)22.0mg 于 100ml 容量瓶中，加 0.1mol/L pH7.4 磷酸盐缓冲液至刻度。4.2，4-二硝基苯肼溶液 称取 2，4-二硝基苯肼 19.8mg，用 10mol/L 盐酸 10 ml 溶解后，加蒸馏水至 100ml，置棕色瓶内，冰箱保存。5.0.4mol/L NaOH 溶液 称取 16gNaOH 溶于适量蒸馏水中，然后稀释至 1 000ml。【操作】取 2 支试管按下表操作：表 3-15 血清 ALT 测定（赖氏法）操作步骤加入物（ml） 测定管 对照管血清 0.
4、1 0.1ALT 底物液 0.5 混匀，置 37 oC 水浴，保温 30 分钟2，4二硝基苯肼 0.5 0.5ALT 底物液 0.5混匀，置 37 oC 水浴，保温 20 分钟0.4mol/L NaOH 5.0 5.0混匀，静置 10 分钟，用 505nm 波长比色，以蒸馏水调零，读取各管吸光度，用测定管吸光度值减去对照管吸光度值，查标准曲线得 ALT 活力单位。【标准曲线绘制】见下表： 表 3-16 血清 ALT 测定（赖氏法）标准曲线绘制操作步骤管 号加入物（ml）0 1 2 3 4 5丙酮酸标准液（2mol/ml） 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25ALT 底物液 0.
5、05 0.45 0.40 0.35 0.30 0.250.1mol/L pH7.4 磷酸盐缓冲液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1混匀，置 37 oC 水浴，保温 30 分钟2，4二硝基苯肼 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05混匀，置 37 oC 水浴，保温 20 分钟0.4mol/L NaOH 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0相当于 ALT 单位 0 28 57 97 150 200混匀，静置 10 分钟，用 505nm 波长比色，以蒸馏水调零，读取各管吸光度，将各管吸光度值减去“0”号管吸光度值，以吸光度为纵坐标，各管相应的酶活性单位为横
6、坐标，绘制成标准曲线。【正常参考范围】525 卡门氏单位赖氏法的酶活力单位是根据本法中丙酮酸量及其吸光度值与卡门氏单位的对等关系，套用卡门氏单位而来。卡门氏单位的定义是：血清 1ml，反应液总量 3ml，反应温度 25，波长 340nm，比色杯光径 1cm，每分钟吸光度减少 0.001 为一个卡门氏单位。【临床意义】ALT 主要存在各组织细胞中，以肝细胞中含量最多，正常情况下只有极少量释放入血，血清中 ALT 活性很低。当肝细胞病变、坏死或肝细胞膜通透性增加时，ALT 可大量释放入血，使血中该酶的活性显著升高，故此酶是判断肝细胞损伤的一个常用的指标。急性肝炎、药物中毒性肝细胞坏死时，血清 ALT 活性明显升高；肝癌、肝硬化、慢性肝炎、心肌梗死时，血清 ALT 活性中度升高；阻塞性黄疸、胆管炎时，血清 ALT 活性轻度升高。【结果及分析】【思考题】1. 血清 ALT 活性升高有何临床意义？2. 简述 ALT 测定的实验原理。（杨友谊）
