1、实验五 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量一、实验目的 1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量的原理与方法 2. 熟练分光光度计的使用和操作方法。 2、实验原理 考马斯亮蓝 G250 测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，它与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。它在酸性溶液中呈棕红色，最大光吸收峰在 465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。考马斯亮蓝 G-250蛋白质复合物呈蓝色，在一定范围内，595nm 下光密度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。 考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法，本方法具有操作方便、快速、干扰因素少的
2、特点。离心机的使用说明： 1.要离心的离心管和管套要称重，重量不等时将水加在管套里。 2离心管的放置是对角线放置，要求必须对称。 3. 先将离心机转速旋钮恢复到零刻度后，再定时间，定好时间后缓慢旋转转速旋钮，使离心机均匀的提速到预定转速。 分光光度计的使用说明： 1.接通电源开关，预热 20min 后，再选择须用的单色光波长。 2.放入已加入溶液的比色皿，盖上样品室盖，推动试样架拉手，使对照比色皿（溶液装入 45 高度，置第一格）置于光路上，调节 100透射比按钮，使吸光度值 A=0.00。 3.推动试样架拉手，使样品比色皿置于光路上，读出吸光度值。 4.测量完毕，取出比色皿，洗净后置于乙醇溶
3、液中浸泡脱色。 5.电源开关置于“关” ，拔下电源插头。 3、试剂与器材： 1. 试剂：（1）0.9NaCl：9g NaCl 溶解在 1L 的容量瓶中。 （2）标准蛋白质：称取 50mg 结晶牛血清蛋白定溶于 50ml 容量瓶里。 （3）染液：考马斯亮蓝 G-250 0.5g，溶于 250mL95%乙醇，再加入500mL85(WV)磷酸，保存于棕色瓶中，称为母液。取 150 mL 然后加蒸馏水定容到 1000mL，保存于棕色瓶中，备用。 2. 器材：试管；吸管 10mL、l5mL、lmL、0.1mL；722 分光光度计 4、操作方法 1. 标准曲线的制备取 6 支试管，按下表加入各试剂： 以各
4、管相应标准蛋白质含量（mg）为横坐标、 A595 为纵坐标，绘制标准管号0 1 2 3 4 5标准蛋白溶液(ml)0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00.9%NaCl 溶液(ml)1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0待测样品(ml) 考马斯亮蓝试剂(ml)5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0摇匀，放置 5min，测吸光度值A595nm曲线。2. 待测样品测定试管中加蛋白质样品 1.0mL ，再加入 5.0mL 考马斯亮蓝 G-250 试剂，摇匀，放置 5min 后，在 595nm 波长下吸光度值，记录 A595。根据所测 A595 从标准曲线上查得蛋白质含量。并计算蛋白样品的浓度（mg/ml） 。5、实验结果及分析6、思考题蛋白质含量的测定还有哪些方法？其优缺点是什么？
