1、实验一 还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法一、实验目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计） 。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红
2、色的 3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在 540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。三、实验材料、主要仪器和试剂1 实验材料小麦面粉；广范 pH 试纸。2 主要仪器（1）大试管：220cm14（2）烧杯：100mL3（3）三角瓶：100mL1（4）容量瓶：100mL3（5）移液管：1mL3；2mL2；10mL4（6）吸耳球、玻璃棒（7）恒温水浴锅（8）漏斗、滤纸（9）白瓷缸、电炉（10）精度天平（
3、11）分光光度计3 试剂（已制备）（1）1mg/mL 葡萄糖标准液准确称取 90烘至恒重的分析纯葡萄糖 100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到 100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至 100mL，混匀，4 冰箱中保存备用。（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂将 6.3g 3,5-二硝基水杨酸（DNS）和 2molL NaOH 溶液 262mL，加到 500mL 含有 185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加 5g 重蒸酚和 5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至 1000mL，贮于棕色瓶中，7-10 天后才能使用。（3）6mol/L HCl 和 6mol/L NaOH 。
4、四、操作步骤1 制作葡萄糖标准曲线取 7 支 220cm 大试管编号，按表 1 分别加入浓度为 1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。表 1 葡萄糖标准曲线制作管 号 葡萄糖含量（mg） 1mg/mL 葡萄糖标准液（mL ） 蒸馏水（mL ） DNS（mL ） 吸光度值（A540）0 0 0 2 1.5 1 0.2 0.2 1.8 1.5 2 0.4 0.4 1.6 1.5 3 0.6 0.6 1.4 1.5 4 0.8 0.8 1.2 1.5 5 1.0 1.0 1.0 1.5 6 1.2 1.2 0.8 1.5 将各管摇匀，
5、在沸水浴中准确加热 5min，取出，用流动水冷却至室温，用蒸馏水补充至20mL（即各加入 16.5mL 蒸馏水） ，震荡混匀，在分光光度计上进行比色。调波长 540nm，用 0 号管调零点，测出 16 号管的吸光度值。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。2 样品中还原糖和总糖的测定（1）还原糖的提取准确称取 3.00g 食用面粉，放入 100mL 烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入 50mL 蒸馏水，搅匀，置于 50恒温水浴中保温 20min，使还原糖浸出。将浸出液用 100mL 容量瓶定容，混匀，过滤，滤液作为还原糖提取液，待测。（2）总糖的水解和提
6、取准确称取 1.00g 食用面粉，放入 100mL 三角瓶中，加 15mL 蒸馏水及 10mL 6mol/L HCl，置沸水浴中加热水解 30min。待三角瓶中的水解液冷却后，用 6mol/L NaOH 中和（大约 10mL 左右） ，用广范 pH 试纸测试中和到 pH=7，用蒸馏水定容在 100mL 容量瓶中，混匀。将定容后的水解液过滤，取滤液 1 mL，移入另一 9mL 水的试管中，混匀，稀释 10 倍 作为总糖待测液。（3）显色和比色取 7 支 220cm 大试管，编号，按表 2 所示分别加入待测液和显色剂，用 7 号管进行空白调零。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。表 2
7、样品还原糖测定管 号还原糖待测液（mL ）总糖待测液（mL ）蒸馏水（mL ）DNS（mL ）吸光度值（A 540）查曲线葡萄糖量（mg）7 2.0 1.58 1.0 1.0 1.5 9 1.0 1.0 1.510 1.0 1.0 1.5 11 1.0 1.0 1.5 12 1.0 1.0 1.513 1.0 1.0 1.5 五、结果与计算：利用 8、9、10 号管吸光度值和 11、12、13 管吸光度值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，分别计算出还原糖和总糖的平均值，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。六、注意事项1 试管、烧杯和三角瓶事先要洗净烘干。2 试管要提前标号。3 移
8、液管使用前要润洗。4 移液管要专管专用。5 分光光度计要预热 30 分钟。6 比色皿要用擦镜纸擦干，尤其是光滑面，更不能用手碰。7 保持环境干净，废液倒在废液缸中，废纸放入垃圾桶中。8 标准曲线制作与样品测定尽量同时进行显色，并使用同一参比溶液调零点和比色。9 用分光光度计比色时，应注意每次都应该把比色皿用蒸馏水洗两遍，再用待测液润洗，之后再装待测液。七、思考题13,5-二硝基水杨酸比色法是如何对总糖进行测定的 ?2比色测定时为什么要设计空白管？八、预习题1. 什么是还原性糖2. 高中学过测定还原性糖的方法是什么？其原理和操作又是什么？3. 操作注意：注意事项中要求，用分光光度计比色时，每次都应该把比色皿用蒸馏水洗两遍，这查曲线所得还原糖毫克数稀释倍数还原糖（%）=样品毫克数 100查曲线所得总糖水解后毫克数稀释倍数总糖（%）=样品毫克数 0.9100是为什么？如果不洗会造成什么影响？
