1、实验四 细菌的接种培养法与生长现象的观察【目的和要求】1掌握无菌技术，建立无菌观念；明确无菌操作时注意要点。2掌握细菌的接种、分离培养方法和接种环的制作方法。3熟悉细菌生长现象的观察方法。【试剂与器材】1菌种：葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌等。2培养基：固体、半固体、液体培养基。3其他：温箱、酒精灯、接种环、接种针、L 形玻棒、打火机、记号笔等。【实验内容】一、细菌的接种工具1接种环和接种针：其结构包括环（针） 、金属柄、绝缘柄三部分（见图 4-1） 。其中环（针）部分最佳材料为白金丝，因其受热和散热速度快，硬度适宜，不易生锈且经久耐用，但因为价格昂贵而限制了其应用。目前实验室常用
2、的是经济实用的 300500W 电热镍鉻丝。一般要求接种环长 58cm，直径为 24mm，定量接种环的容量为 0.001ml。图 4-1 接种环和接种针接种环（针）在使用之前需检查镍鉻丝是否呈直线，若有弯曲，需用吸管或接种环的另一端将其压直；若环不圆，可将镍鉻丝前端放在吸管尖部缠绕一圈，再将镍鉻丝突出的部分朝内压紧。接种环用于固体、液体培养基的接种，接种针用于半固体培养基的接种。2L 形玻棒：由直径 23mm 的玻璃棒弯曲成 L 形制成。在使用之前用厚纸包扎后置高压蒸汽灭菌，或沾取无水乙醇后在火焰上烧灼灭菌。主要用于液体标本涂布接种。二、细菌的接种方法1液体培养基的接种 该法主要用于细菌的增菌
3、培养或进行细菌的生化反应。方法：（图 4-2）（1）先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许细菌。（2）左手拿试管，右手持接种环，用右手其余手指将试管塞打开，试管口通过火焰烧灼灭菌。（3）将接种环在贴近液面的管壁上上下碾磨数次，使细菌均匀分布于培养基中。（4）将试管口灭菌后加塞，接种环烧灼灭菌后放回原处。（5）在试管上做好标记，经 35培养 1824h 后观察结果。图 4-2 液体培养基接种法2半固体培养基的接种该法可用于保存菌种、观察细菌的动力或进行细菌的生化反应。方法：（图 4-3）（1）先将接种针在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许菌落。（2）左手拿试管，右手持接种针，将试管塞打开后，
4、试管口通过火焰灭菌，将接种针从培养基的中心向下垂直穿刺接种至试管底上方约 5mm 处（勿穿至管底） ，然后由原穿刺线退出，（3）将试管口灭菌后加塞，接种针烧灼灭菌后放回原处。（4）在试管上做好标记，经 35培养 1824h 后观察结果。图 4-3 半固体培养基接种法3平板划线接种法该法可将标本中的多种细菌分散成单个菌落，有利于细菌的分纯和进一步鉴定。方法：（1）连续划线法（图 4-4）1）先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许菌落。2）左手斜持平板，用手掌托着平板底部，五指固定平板边缘，在酒精灯旁以拇指、食指和中指将平板盖撑开大约 3045角，将已挑取细菌的接种环先在平板一侧边缘均匀涂布
5、，然后运用腕力将接种环在平板上自上而下，来回划线。划线要密，但不能重叠，充分利用平板的面积，不能划破琼脂表面，并注意无菌操作，避免空气中的细菌污染。3）划线完毕，将平板扣入平板盖，接种环烧灼灭菌后放回原处。4）在平板底上做好标记，经 35培养 1824h 后观察结果。图 4-4 固体培养基连续划线法（2）分区划线法（图 4-5）1）先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许菌落。2）同上法将平板盖打开约 3045角，将已挑取细菌的接种环在平板一端（1 区）内作来回划线，再在 2、3、4 区依次划线，每区的划线须有数条线与上区交叉接触，每划完一区是否需要烧灼接种环依标本中的菌量多少而定，每区线
6、间需保持一定距离，线条要密而不重复。3）划线完毕，将平板扣入平板盖，接种环烧灼灭菌后放回原处。4）在平板底上做好标记，经 35培养 1824h 后观察结果。图 4-5 固体培养基分区划线法4斜面培养基接种法（图 4-6）斜面培养基主要用于细菌的纯培养，以进一步鉴定细菌或保存菌种。（1）将接种环（或接种针）在火焰上烧灼灭菌，待冷却后以无菌操作挑取少许菌落。（2）左手拿试管，打开试管塞后，试管口通过火焰灭菌，再将取有细菌的接种环由斜面底部向上划一直线，再由下至上在斜面上作曲线划线。（3）试管口灭菌后加塞，接种环烧灼灭菌后放回原处。（4）在试管上做好标记，经 35培养 1824h 后观察结果。图 4
7、-6 斜面培养基接种法5涂布接种法本法主要用于活菌计数和药敏试验。（1）活菌计数：取一定稀释度的菌液 0.1ml 滴在平板上，用无菌 L 型玻璃棒将液滴涂布均匀，盖上平板盖，经 35培养 1824h 后计数菌落，则每毫升所含活菌数=菌落数10稀释倍数。（2）直接涂布法：多用于纸片法和管碟法药敏试验。先配制一定浓度的菌液，用无菌棉签蘸取菌液后，在管壁上将多余的液体挤去，在 MH 琼脂平板上按三个方向均匀涂布 3次，最后沿平板边缘涂一周。盖上平板盖，置室温放置 5min 使平板表面稍干，然后用无菌镊子将药敏纸片贴在培养基表面，或向竖在平板表面的牛津小杯内加入不同浓度的药物，经 35培养 1824h
8、 后观察结果，测定抑菌圈直径，按判断标准判定结果。6倾注培养法此法常用于标本或样品中活菌计数。（1）方法：1）将标本用无菌生理盐水稀释成不同浓度：10 -1、10 -2、10 -3、10 -4、10 -5 等。2）取不同稀释度的标本各 1ml 分别注入直径 90mm 无菌平皿，迅速加入溶化并冷却至约 50的营养琼脂 15ml，轻轻转动平板使之充分混匀，待凝固后翻转平板。3）置 35温箱孵育 1824h，计数菌落形成单位（colony forming unit，CFU ） ，按下式算出每 ml 标本中的细菌数：1ml 标本中的活菌数=全平板 CFU稀释倍数7细菌接种的注意事项（1）细菌接种过程中
9、需注意无菌操作，避免污染，因此每一步操作均需严格按要求进行。操作时不宜说话或将口鼻靠近培养基表面，以免呼吸道排出的细菌污染培养基。（2）所有操作均需在酒精灯火焰附近进行，平皿盖、试管塞、瓶塞均应拿在手上打开（具体见前述） ，禁止将盖或塞事先取下放置在桌面上。（3）取菌种前灼烧接种针（环）时要将镍鉻丝烧红，烧红的接种针（环）稍事冷却再取菌种，以免烧死菌种。（4）取菌时注意菌落不要取得太多，应蘸取而不宜刮取，否则平板划线很难分离出单个菌落。（5）平板划线时注意掌握好划线的力度和角度，用力不能过重，接种环和培养基表面大约呈 3040角，划线要密而不重复，充分利用培养基，并注意不能划破平板。半固体培养
10、基接种时注意穿刺线要直，并沿原穿刺线退出。（6）接种完毕后，需在培养基上做好标记再放置温箱孵育。废弃的有菌材料（如玻片、有菌的平板、试管、吸管等）均需灭菌后再清洗。发生有菌材料污染应及时进行消毒处理。三、细菌的培养方法1需氧培养法 该法适用于需氧菌和兼性厌氧菌。将接种后的培养基（试管放试管架上，平板底上盖下）置 35培养箱，培养 18-24h。大多数细菌生长速度快，在孵育 1824h 后即可见到生长现象，但若标本中的菌量少或生长速度慢的细菌（如结核分支杆菌） ，则需培养 37 天甚至 48 周后才能观察到生长现象。2CO 2 培养法（1）CO 2 孵育箱：能自动调节箱内 CO2 的浓度和温度，
11、使用方便。（2）烛缸法：取一有盖磨口标本缸或玻璃干燥器，在盖及磨口处上涂上凡士林。将接种后的培养基放入缸中，并在缸内放一支点燃的蜡烛，加盖密封。随着缸内蜡烛燃烧产生的 CO2 增加，蜡烛逐渐自行熄灭，此时缸内的 CO2 浓度约为 510%，置 35培养箱孵育1824h 后观察结果。 （见图 4-7）图 4-7 烛缸法（3）化学法（重碳酸钠-盐酸法）：按每升容积重碳酸钠 0.4g 与 1mol/L 盐酸 0.35ml比例，分别将二种试剂置于容器内，将容器放置在标本缸中，密封后倾斜容器，使二种试剂接触混合产生 CO2。该法适用于奈瑟菌和布鲁菌等苛养菌的培养。3微需氧培养：先用真空泵将容器内的空气排
12、尽，再注入 5%O2、10%CO 2、85%N 2的混合气体，然后置于 35培养箱孵育后观察结果。该法适用于空肠弯曲菌、幽门螺杆菌等微需氧菌的分离培养。4厌氧培养法：（1）厌氧罐培养法：用理化方法使容器内形成无氧环境，用于专性厌氧菌培养。常用的方法有抽气换气法和气体发生袋法。1）抽气换气法：将已接种的培养基放入真空干燥缸或厌氧罐中，再放入催化剂钯粒和指示剂美蓝。先用真空泵将缸内抽成负压 99.99kPa（750mmHg） ，再充入无氧氮气，反复三次，最后充入 80%N2、10%H 2 和 10%CO2 混合气体，若缸内呈无氧状态，则指示剂美蓝为无色。每次观察标本后需重新抽气换气，用过的钯粒经
13、1602h 干烤后可重复使用。2）气体发生袋法（Gas-pak 法）：该法需以下二种容器：厌氧罐是由透明聚碳酸酯或不锈钢制成，盖内有金属网状容器，其内装有厌氧指示剂美蓝和用铝箔包裹的催化剂钯粒；气体发生袋是一种铝箔袋，其内装有硼氢化钠- 氯化钴合剂、碳酸氢钠- 柠檬酸合剂各 1 丸和 1 张滤纸条，使用时剪去特定部位，注入 10ml 水，水沿滤纸渗入到二种试剂中，发生下列化学反应，产生 H2 和 CO2。立即将气体发生袋放入罐内，密封罐盖，使气体释放到罐中。C6H8O7+3NaHCO3Na 3(C6H5O7)+3H2O+3CO2NaBH4+2H2ONaBO 2+4H2（2）厌氧袋法：厌氧袋是用
14、无毒透明、不透气的复合塑料薄膜制成。袋中装有催化剂钯粒和 2 支安瓿，分别装有 H2、CO 2 发生器（化学药品，成分同上） 、指示剂美蓝。使用时将接种细菌的平板放入袋中，密封袋口，先将袋中装有化学药品的安瓿折断，几分钟后再折断装有美蓝的安瓿，若美蓝为无色则表示袋内已处于无氧状态，置 35温箱孵育。（3）需氧菌共生法：将已知专性需氧菌（如枯草芽胞杆菌）和待检厌氧菌分别接种到2 个大小相同的平板上，将两者合拢，缝隙用透明胶密封，置 35温箱培养，需氧菌生长过程中消耗氧气，待氧气耗尽后，厌氧菌即开始生长。（4）平皿焦性没食子酸法：按每 100ml 容积加入焦性没食子酸 1g 和 2.5mol/LN
15、aOH 10ml（也可用 Na2CO3）的比例，先将焦性没食子酸放入平皿盖背面的灭菌纱布中，再滴入NaOH，立即将接种细菌的平板扣上，用熔化的石蜡密封平皿和平皿盖的缝隙，置 35温箱培养。（5）庖肉培养基法：将庖肉培养基上面的石蜡熔化，用毛细管吸取标本后接种于培养基中，待石蜡凝固后置 37孵育。用于培养基中的肉渣可吸收氧气，石蜡凝固后起隔绝空气的作用，从而使培养基内呈无氧状态。（6）厌氧手套箱培养法：厌氧手套箱是目前国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作。箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。使
16、用时将物品放入箱内，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气、换气（H 2，CO 2，N 2）使之达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。箱内保持厌氧状态，是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中残余氧化合成水的原理。该箱可调节温度，本身是孵箱或将孵箱附在其内。该法适于作厌氧菌的大量培养研究。四、细菌生长现象的观察1液体培养基中的生长现象：浑浊生长（如葡萄球菌） 、沉淀生长（如链球菌） 、菌膜生长（如枯草杆菌） 。观察要点：注意观察培养基的透明度、管底和液面上是否有细菌生长。2半固体培养基中的生长现象：（1）无鞭毛的细菌：仅沿穿刺线生长，穿刺线清晰，周围培养基透明（如葡萄球菌） 。（2）有鞭毛的细菌：沿穿刺线向四周扩散生长，穿刺线边缘呈羽毛状，周围培养基变浑浊（如大肠埃希菌） 。观察要点：注意观察穿刺线是否清晰、周围的培养基是否混浊。3固体培养基中的生长现象：菌落：由一个细菌生长繁殖而形成的一个肉眼可见的细菌集团。因来源相同，同一个菌落的细菌为纯种细菌。不同细菌菌落的形态学特征不同，可以鉴别细菌。菌苔：由多个菌落融合而成，可能含有杂菌。菌落性状的描述：大小、形状、颜色、凸扁、表面光滑度、湿润度、光泽、透明度、边缘、粘度、溶血（血平板） 、气味等。【结果记录和报告
