1、实验六 淀粉酶的专一性和温度、pH、激活剂及抑制剂对酶活性的影响实验类型：验证型目的和要求1.通过本实验观察、验证酶的专一性和温度、pH、激动剂及抑制剂对酶活性的影响。2.熟悉淀粉及其酶解产物的特殊显色方法；电热恒温水浴的使用。 3.了解唾液淀粉酶的收集与预处理。原理酶具有高度专一性，一种酶只能催化一种或一类底物发生反应，如淀粉酶只能水解淀粉，不能水解蔗糖。当淀粉被淀粉酶彻底水解为还原性麦芽糖和葡萄糖时，能使班氏试剂的 Cu2+还原成 Cu1+，生成砖红色 Cu2O 沉淀。淀粉酶的活性受温度、pH、激动剂及抑制剂、酶浓度以及作用时间等多种因素影响，因而水解淀粉生成一系列分子大小不同的糊精。不同
2、程度的水解糊精可与碘反应生成紫色、棕色或红色络合物。通过上述特征性反应，并以蔗糖等作对照，便可观察、验证淀粉酶是否具有专一性以及它的催化活性是否受到影响。操作方法一、唾液淀粉酶的收集与处理1.制备唾液实验者先将痰咳尽，用自来水漱口，以清除口腔内食物残渣，再在口腔内含蒸馏水约15ml，并作咀嚼咕漱运动，3 分钟后吐入垫有两层经润湿处理的脱脂纱布的漏斗内，过滤于小烧杯中备用，为与下面稀释唾液相区别，此称制备唾液。2.煮沸唾液取上述唾液约 2ml，盛入 1 中号试管中,置沸水浴煮沸 5 分钟备用。3.稀释唾液调整唾液淀粉酶活性，使之在 pH6.8、37和既无激动剂又无抑制剂条件下，作用 5min，水
3、解淀粉至红色糊精为宜。具体做法是取 12 凹白瓷反应板一块，按下列步骤操作：第 1 排每凹各加 1 滴制备唾液，1 2、1 3、1 4凹分别加生理盐水 1、2、3 滴，用滴管采用抽吸法，由稀到浓（1 41 2）小心混匀各凹，勿使溅入相邻凹中。每混匀一凹便取其 1 滴放入同列的 2 排凹中，剩余稀释唾液应全部放回原凹中。在盛有不同稀释度唾液的第 2 排各凹中，均加入 4 滴缓冲液（pH6.8），2 滴 1%的淀粉液和 2 滴蒸馏水，用混匀法充分混匀，置 37下 5min。在第 2 排各凹中加 I 液一滴，混匀，观察比较各凹颜色，以浅棕- 红色对应的稀释倍数，用生理盐水稀释 3ml 制备唾液备用。
4、二、唾液淀粉酶的专一性以及温度、pH、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活性影响的观察（一）取试管 3 支编号，按下表 1 操作表 1 唾液淀粉酶专一性的实验观察试剂 试管pH6.8 缓冲液1淀粉溶液1蔗糖溶液制备唾液 煮沸唾液1 20 滴 10 滴 5 滴 2 20 滴 10 滴 5 滴3 20 滴 10 滴 5 滴 将上述各管混匀后，置 37水浴中保温 10 分钟，然后每管加入班氏试剂 20 滴，再放入沸水浴中煮沸约 15 分钟，观察各管颜色反应，并说明原因。（二）温度影响酶促反应的实验观察1.取试管 3 支编号，按下表 2 操作：表 2 温度影响酶促反应的实验观察管号试剂1 2 31.pH6.8
5、 缓冲液 20 滴 20 滴 20 滴2.1淀粉溶液 10 滴 10 滴 10 滴3.预热 5min 37水浴 沸水浴 冰浴4.直接加入稀释唾液，立即混匀、计时5 滴 5 滴 5 滴5.保温 10min 37水浴 沸水浴 冰浴2.将一、二管移入冰水浴中，待各管温度一致后速向各管加入碘液 1 滴，混匀后观察各管颜色的区别，并说明温度对酶促反应的影响。四、pH 影响酶促反应的实验观察1. 取试管 3 支编号，按下表 3 操作：表 3 pH 影响酶促反应的实验观察pH4.0 缓冲液 pH6.8 缓冲液pH8.0 缓冲液1淀粉溶液稀释唾液试管 1 20 滴 10 滴 5 滴试管 2 20 滴 10 滴
6、 5 滴试管 3 20 滴 10 滴 5 滴2.将上述各管混匀后，置 37水浴中保温 10 分钟，然后每管加入碘液 1 滴，混匀后观察各管颜色的区别，并说明 pH 对酶促反应的影响。五、激动剂和抑制剂影响酶活性的实验观察1. 取试管 4 支编号，按下操作：表 4 激动剂和抑制剂影响酶活性的实验观察pH 6.8缓冲液1淀粉溶液蒸馏水 0.9NaCl1CuSO41Na 2SO4稀释唾液1 20 滴 10 滴 10 滴 5 滴2 20 滴 10 滴 10 滴 5 滴3 20 滴 10 滴 10 滴 5 滴4 20 滴 10 滴 10 滴 5 滴2. 将上述各管放入 37水浴中保温 10 分钟怎么减肚
7、子，然后每管加入碘液 1 滴，混匀后观各管颜色的区别，并说明激动剂和抑制剂对酶促反应的影响。注意事项1.反应试管应清洗干净，不同酶液、试剂及其滴管不能交叉混用；2.使用混合唾液，或通过预试选出合适的唾液稀释度，效果更为显著。试剂和器材一、器材1.滴管、烧杯、试管（架）及试管夹 。2.恒温水浴箱与水浴锅。3.脱脂棉、漏斗及纱布。4.白瓷反应盘二、试剂1.1淀粉 称取淀粉 1g，岳阳家政加少量水调成糊状，加入煮沸的 0.3NaCl 溶液至 100m1。2.1蔗糖溶液3.班氏试剂 A 液：取柠檬酸钠 173，无水碳酸钠 100，加水 600ml，加热溶解，冷却后稀释至 850ml；B 液：取结晶硫酸
8、铜（CuSO 45H2O）17.3溶于 100ml 预热的蒸馏水中，冷却后加水至 150ml。将 A 液缓慢倒入 B 液中混匀置试剂瓶备用。4.碘液：称取碘 4g、碘化钾 6g 溶于 l000ml 蒸馏水中，置棕色瓶内贮存备用。5.各种 pH 缓冲液pH6.8 缓冲液：取 0.2mol/LNa2HPO4溶液 772ml，0.1mol/L 怎么减肚子柠檬酸溶液228ml 混合即成。 pH4.0 缓冲液：取 0.2mol/LNa2HPO4溶液 385.5ml，0.1mol/L 柠檬酸溶液 614.5ml混合即成。 pH8.0 缓冲液：取 0.2mol/LNa2HPO4溶液 972ml，0.1mol/L 柠檬酸溶液 28ml 混合即成。6.0.9 NaCl 溶液7.1CuSO 4 溶液 8.1Na 2SO4溶液思考题1.简述温度、pH、激动剂及抑制剂排毒养颜胶囊、酶浓度等因素影响对淀粉酶活性的影响。2.简述淀粉酶活性测定的原理及注意事项。
