1、生化分离工程,复习,据各种资料统计，分离纯化过程所需的费用要占产品总成本的很大比例，按产品不同。对抗生素生产而言，分离纯化部分的投资费用约为发酵部分的4倍；对有机酸或氨基酸生产而言，则为1.5倍；对基因工程药物，分离纯化技术的要求更高，如重组DNA蛋白质精制的费用可占整个生产费用的8090%；对于血液制品，分离纯化几乎占整个生产费用的100%。因此人们逐渐认识到下游工程的落后有可能会阻碍生物技术的发展。,一、 分离纯化的一般步骤,(1) 发酵液的预处理和固液分离 ；(2) 初步分离(提取) ；(3) 高度纯化(精制) ；(4) 成品加工。,二、多肽和蛋白质的纯化,多肽和蛋白质的纯化包括两部分内
2、容。一是将蛋白质与非蛋白质分开，二是将不同的蛋白质分开。对非蛋白部分可以根据其性质采用适当的方法去除。而对于不同蛋白质的分离则可以利用它们之间性质上的差异进行。常用的方法有:(一)利用溶解度不同的纯化方法 有盐析法、有机溶剂法、等电点沉淀法、加热变性法等。(二)利用分子形状和大小不同的纯化方法 凝胶层析法、透析法等。(三)利用电离性质不同的纯化方法 离子交换法、电泳法等。(四)利用生物功能专一性的不同纯化蛋白质 亲和层析法等。,三、蛋白质分离纯化举例,3.1 重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（human granulocyte-macrophage colony
3、 stimulating factor, GM-CSF）是一种可由体内多种细胞产生的细胞因子，如激活的T、B淋巴细胞、成纤维细胞、内皮细胞等，可作用于造血干细胞，促进其增殖、分化，形成中性粒细胞和巨噬细胞群，同时还能刺激噬酸性粒细胞、巨核细胞、多浅能性和早期红细胞的形成和增殖。 1993年获美国FDA批准重组GM-CSF（rhGM-CSF）用于临床。主要用于治疗肿瘤化疗产生的造血障碍、再生障碍性贫血、骨髓异常增生综合征等，还用于增强免疫、骨髓移植等。,3.1.1 GM-CSF的特性,分泌到细胞外的成熟人由127个氨基酸残基组成，分子量为22kD。不同来源的GM-CSF分子量范围为14.5kD3
4、5kD，分子量差异是由糖基化程度不同造成的。但糖基化程度不同的GM-CSF生物学活性却没有明显的不同，甚至有报道大肠杆菌表达的非糖基化GM-CSF比真核细胞表达的糖基化GM-CSF具有更高的生物学活性。 GM-CSF的分子由两个反向平行的折叠和四个反向平行的螺旋组成，有两个二硫键分别连接螺旋B和折叠的第二条链、螺旋C和羧基末端。rhGM-CSF的pI为5.4。,3.1.2 GM-CSF的分离和纯化,本例是以包涵体的形式进行表达的。I)收集菌体细胞 发酵后的工程菌以7000r/min离心30min，用50mmol/L Tris-盐酸缓冲液反复洗涤、离心3次，去上清液。II)细胞破碎与包涵体的收集
5、 沉淀（菌体细胞）加4倍体积20mmol/L磷酸盐缓冲液(含5mmol/L EDTA)，冷浴搅匀，置超声破碎器中破菌，每次30s，间隔30s，反复破碎直至革兰染色镜检无完整的菌体止。5000g离心30min，去上清，沉淀即含有包涵体。,3.1.2 GM-CSF的分离和纯化,III)包涵体的洗涤上述沉淀加入9倍体积20mmol/L磷酸盐缓冲液(含0.5%TritonX I00)，5000g离心30min，沉淀加入9倍体积20mmol/L磷酸盐缓冲液(含0.5mol/L脲)，同法离心，沉淀加入6倍体积20mmol磷酸盐缓冲液(含5mmol/L EDTA)，以10000g离心30min，收集沉淀。I
6、V)包涵体的变性与复性上步沉淀加入8mol/L脲溶液，振摇l2h，40000g离心30min。用逐步稀释法将上清液脲浓度稀释至0.lmol/L，复性24h，以17000g离心30min，上清液即为复性的rhGM-CSF粗产品。,3.1.2 GM-CSF的分离和纯化,V)色谱法纯化 V-I）疏水色谱 将Phenyl-Sepharose 6 FF色谱柱用50mmol/L磷酸-7%（NH4)2SO4液(pH6.9)平衡。 复性粗产品加入（NH4)2SO4 使其浓度达7%(w/v)，上样。 用50mmol/L磷酸-7%（NH4)2SO4液(pH6.9)、20mmol磷酸盐缓冲液（pH7.0）及30%异
7、丙醇依次洗脱，280nm紫外检测，收集洗脱峰，电泳（银染色）检定。,3.1.2 GM-CSF的分离和纯化,V-II）离子交换色谱 装DEAE-Sepharose FF色谱柱，以20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)平衡至基线。加上步得到的目的产物，以20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)、20mmol/L磷酸盐-0.l5mol/L NaCl液(pH6.5)、20mmol/L磷酸盐-lmol/L NaCl液(pH6.4)分别洗脱，收集洗脱峰，电泳检定。,3.1.2 GM-CSF的分离和纯化,V-III）凝胶色谱 装Sephacryl S 200色谱柱，以20mmol/L磷酸盐-0.l5m
8、ol/L NaCl液(pH6.5)平衡，上步目的产物上样后以相同的缓冲液进行洗脱，收集吸收峰，产品经0.2m滤膜过滤。本法所得rhGM-CSF产品，经HPLC检测为单一峰，纯度为99%；SDS-PAGE显示为一条带，分子量为14kD；生物活性为1.591071.86107u/mg,3.2 人神经细胞生长因子,神经生长因子（nerve growth factor, NGF）是神经系统最重要的生物活性分子之一，也是最早发现和最典型的神经营养因子，它们影响外周神经及中枢神经系统某些神经元的存活与分化，可促进损伤神经系统的再生与修复。NGF还具有免疫调节作用。,3.2.1 NGF的特性,人NGF（hN
9、GF）的前肽原含241个氨基酸残基，信号肽为18个氨基酸残基。 成熟hNGF为l20个氨基酸残基，分子量为1.3kD，有1个N-糖基化位点，6个Cys残基，形成3个链内二硫键，pI为8.86。 在体内以二聚体存在。,3.2.2 分离纯化,本例是以人胎盘为原料提取hNGF。 I). 胎盘绒毛的分离 取人足月胎盘，用注射器向脐带总动脉注入生理盐水，并轻揉胎盘，直至洗尽血污，分离绒毛叶。,3.2.2 分离纯化 II) 提取,将来自100个胎盘的绒毛叶28kg剪碎，加20%（v/w）预冷的PBS(pH6.8，含lmmol/L EDTA)，匀浆，每次3min，共3次。 匀浆液在4C 8000r/min离
10、心30min，上清以尼龙膜过滤，除去脂肪。滤液中加尿素至5mol/L，并调pH至4.0，静置2h，以解离hNGF高分子聚合体。8000r/min离心30min，收集上清液。,3.2.2 分离纯化 III) 超滤分离,上清液以分子量截留值为30kD的超滤膜超滤，滤液再用10kD的超滤膜超滤，当截留液剩下约1000ml时，在其中加pH4.0、50mmol/L NaAc-HAc(含0.4mol/L NaCl)缓冲液(平衡缓冲液)2000ml，再浓缩至1000ml，反复5次，收集截留液，对平衡缓冲液充分透析。,3.2.2 分离纯化 IV) 离子交换色谱纯化,透析液上预先以平衡缓冲液平衡的CM52离子交
11、换纤维素(9.2cm30cm)柱，上完样后以平衡缓冲液洗脱穿过峰，换用pH9.0、50mmol/L Tris-盐酸缓冲液洗脱，最后以pH9.0、含0.5mol/L NaCl的50mmol/L Tris-盐酸缓冲液洗脱，收集洗脱峰(含hNGF)。本制备工艺从100个胎盘可提取纯化得hNGF约148.6mg，比活约为15000u/mg；产品经SDS-PAGE银染显示其分子量约14.4kD，为单一条带；经TSK2000SW HPLC层析得到单一峰。,包涵体,多数重组蛋白表达产物是以不溶性表达产物存在于细胞内的，这种不溶性表达产物称为包涵体。这类产物的分离制备相对较复杂。包涵体基本上由蛋白质组成，其中
12、大部分是克隆基因表达产物，因无正确折叠的立体结构而没有活性。其它成分有细胞RNA聚合酶、膜蛋白、核糖体RNA、质粒DNA和质粒编码蛋白以及脂质、肽聚糖、脂多糖等。,(1) 包涵体的制备与处理,包涵体的制备主要包括菌体细胞的破碎与包涵体的洗涤与收集两步。菌体的破碎可用前面所述的各种方法，如超声波法。包涵体的洗涤与收集一般采用含不同添加剂的磷酸盐缓冲液通过离心进行，收集沉淀。,(2) 从包涵体中获取活性蛋白,从包涵体中获取活性蛋白，需要对其进行处理。对包涵体产物的处理包括三个步骤：包涵体溶解前处理在变性条件下溶解包涵体可将表达产物变为可溶形式，以利于分离纯化。在溶解包涵体前，先用温和表面活性剂(如
13、Triton X-100)或低浓度弱变性剂(如尿素)处理，除去脂质和部分膜蛋白，使用浓度以不溶解包涵体中的表达产物为原则。,(2) 从包涵体中获取活性蛋白,包涵体溶解和表达产物变性溶解包涵体通常使用变性剂盐酸胍和尿素以及表面活性剂SDS。这三种试剂溶解包涵体原理不同。盐酸胍和尿素破坏离子间相互作用，解除维系蛋白质稳定性的非共价键，引起蛋白质的去折叠和变性，但它们不破坏共价键；SDS主要破坏蛋白质肽键间的疏水相互作用,(2) 从包涵体中获取活性蛋白,由于表达产物、宿主以及培养和诱导条件的差异，溶解包涵体所用的试剂和浓度也会有很大差异，一般先进行予试验，测定包涵体中表达产物开始溶解和完全溶解所需试
14、剂浓度及作用时间。一般能使表达产物溶解的盐酸胍浓度为58mol/L，尿素为68mol/L，SDS浓度在l%2%(w/v)之间。不同溶解剂对层析分离影响不同，也需要予以关注。,(2) 从包涵体中获取活性蛋白,重组蛋白的复性 溶解的包涵体中重组蛋白的复性主要有两种方法：一是将溶液稀释，使变性剂浓度变低，促使蛋白质复性；另一种方法是用透析、超滤或电渗析法除去变性剂。 包涵体中蛋白质产物如含有两个以上二硫键有可能会发生错误连接。为此，在复性之前需用还原剂打断S-S键，使其变为-SH，复性后再加入氧化剂使两个-SH形成正确的二硫键。常用的还原剂有：二硫苏糖醇（DTT）、-巯基乙醇、还原形谷胱甘肽。常用的氧化剂有：氧化型谷胱甘肽和空气（在碱性条件下）。,谢谢大家！,
