1、细胞凋亡与疾病,概述 APO的过程和主要变化 APO的调控 APO调控异常与疾病 与APO有关的疾病的防治,1965年，澳大利亚病理学教授Kerr在对肝组织细胞组化研究时，发现不明颗粒。结扎大鼠肝门静脉后数小时，肝脏出现坏死，但同时他还发现有些肝细胞不断变圆并形成原生质小团，其中有高度凝聚的染色质颗粒，组化分析显示：原生质小团中,溶酶体未被破坏，说明不同于坏死。后来又在健康大鼠体内发现类似的原生质小团。Kerr等进一步利用电镜技术证明两类死亡在形态上的差别，并于1972年正式提出apoptosis一词。,2002年诺贝尔生理与医学奖获得者,2002年10月7日英国人悉尼布雷诺尔、美国人罗伯特霍
2、维茨和英国人约翰苏尔斯顿，因在器官发育的遗传调控和细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔诺贝尔生理与医学奖,Sydney Brenner,H. Robert Horvitz,John E. Sulston,概述,细胞凋亡(apoptosis，APO),在生理和病理条件下，由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程，即细胞在自身基因调控下进行的一种主动死亡过程，故又称程序性细胞死亡(PCD)。 有人认为前者为形态学概念，后者为功能性概念。,控制细胞凋亡的基因又称为“自杀基因”。,细胞坏死与凋亡的比较,APO的过程,诱导期,效应期,降解期,APO的主要变化（图）,形态学改变：细胞皱缩、胞膜
3、空泡化、胞核固缩、胞膜内陷形成凋亡小体胞膜：细胞缩小、与周围脱离接触，胞浆脱水，胞膜空泡化，细胞出现固缩。胞质：内质网疏松、扩张，和胞膜融合，形成出芽；核糖体、溶酶体、线粒体等聚集，但结构变化不大。胞核：染色质逐渐凝集成新月状，出现边集附于核膜，嗜碱性增强，进而核仁裂解。凋亡小体：胞膜皱缩内陷，分割包裹胞浆，形成的泡状小体。小体内有胞浆碎裂的核物质和亚微结构。清除：凋亡小体被周围吞噬细胞吞噬降解。,核酸内切酶(DNase)的激活与DNA的片段化：,DNase：凋亡蛋白酶激活的DNA酶（CAD）被激活后，（caspase 水解ICAD后，ICAD与CAD 分离，进入胞核。）先将DNA水解为50-
4、300kb片段，然后，在染色质中的基本结构单位核小体之间的连接区将DNA内切成180bp倍数的核苷酸片段DNA的片段化，呈梯状电泳现象。Ca2+/Mg2+可增强DNase活性，Zn2+可抑制DNase活性。,2.生化改变：重要变化为DNA的片段化断裂和蛋白质的降解.,凋亡蛋白酶(caspase)的激活及作用: caspase为天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶又称半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶。它们有两个特征： 都是含有半胱氨酸的蛋白酶； 作用部位都在天冬氨酸残基后的位点。 最早发现的是ICE(即caspase-1)。已发现14个成员，这些caspases成员在氨基酸序列、空间结构及底物特异性上均有相似性；
5、合成前均以凋亡蛋白酶前体（酶原）(procaspase)(30-50kD)形式存在 。,Procaspase的结构特点,procaspase可被切割为大约20kD和10kD的两个大小亚基及一个NH2末端结构域。各结构域之间由天冬氨酸水解酶识别结构分隔。 (1)NH2末端结构域的序列和长度高度变异，这可能与caspase所表现的不同功能及活化机制有关。(2)所有procaspase的各结构域之间具有相同的分割区域，即它有自身活化或被具有相同结构特点的酶活化。 procaspase被激活的过程相似 ，即通过功能区间特异位点的蛋白酶解，继而以大小亚单位形式形成异源二聚体，进一步形成四聚体（caspa
6、se活化）。,依据caspases结构和功能的不同又可分为三大类：,启动子caspase：包括具有长N端前区的caspase-2,8,9,10，能对凋亡信号作出反应，启动细胞的自杀过程； 其中8、10的N端结构域含死亡效应子区(DED)，而9含的是类似DED的caspase募集功能域(CARD)。效应子caspase：包括具有短N端前区的caspase-3,6,7,是细胞凋亡的执行者，能水解特定蛋白底物。 与炎症有关的caspase：1,4,5,11,12,13,14。,信号,TNF相关蛋白,存活因素缺失化疗药物发育信号,Caspases活化因子,死亡受体,细胞色素C释放,Apaf-1,FAD
7、D,起始Caspase,效应Caspase,Caspase-3（-6，-7）,Caspase8（-10）,Caspase-9,执行凋亡（裂解凋亡调控因子，裂解看家蛋白，DNA断裂),Caspases的活化与级联反应,Caspases酶解底物有60多种,Caspases自身IL-1前体、PARP(聚ADP-核糖聚合酶：参与DNA修复)Lamina(核纤层蛋白:被Caspase破坏后，核随即裂解)DNA-PK (DNA依赖的蛋白激酶：参与DNA修复)细胞骨架蛋白:被Caspase水解后,形成凋亡小体hnRNP（不均质核糖核蛋白）ICAD（凋亡蛋白酶激活的DNA酶抑制物：被Caspase水解后，使C
8、AD活化，并使DNA的片段化。）,Caspase的作用：,灭活细胞凋亡的抑制物(ICAD；Bcl-2);水解蛋白质结构，导致细胞解体，形成凋亡小体：Lamina(核纤层蛋白)，被Caspase破坏后，核随即裂解。分解与细胞骨架构成相关的蛋白：PAK2可使细胞结构重组并凋亡。瓦解核结构成核碎片。参与凋亡级联反应，如：启动子caspase-9可使caspase-3前体水解效应子caspase-3。,钙离子的动员：胞内Ca2+增多，激活钙依赖性的酶如核酸内切酶、钙蛋白酶、谷氨酰胺转移酶，分别可导致DNA降解和染色质凝集、细胞骨架紊乱与细胞皱缩，以及胞质蛋白质交联（如谷氨酰与赖氨酸基交联）、维持凋亡小
9、体完整、防止细胞内涵物外溢等；,APO的调控（一）细胞凋亡信号,生理性凋亡信号某些激素和细胞因子的直接作用 糖皮质激素淋巴细胞凋亡 甲状腺素蝌蚪尾巴凋亡 TNF多种细胞凋亡某些激素和细胞因子的间接作用 睾丸组织睾丸酮前列腺上皮细胞凋亡 腺垂体ACTH 肾上腺皮质细胞凋亡,病理性凋亡信号诱导性的因素： 微生物 细菌、病毒 理化因素 射线、化学毒物、氧自由基 化疗药物 多途径诱导癌细胞凋亡 免疫性因素 CTL分泌粒酶致靶细胞凋亡抑制性的因素： 化学促癌物 某些病毒（EB、乳头状瘤）,（二）APO信号的转导 APO信号转导系统是连接诱导性因素与核DNA片段化断裂及细胞结构蛋白降解的中间环节。,APO
10、信号的转导的通路：1.死亡受体激活途径：由死亡因子(TNF、FasL等)与胞膜受体(如TNFR1、Fas、DR3)结合而激活胞内信号转导。,死亡诱导信号复合物DISC,Fas,细胞膜,肿瘤坏死因子受体家族,胞外,抗Fas抗体、免疫细胞表面的FasL及可溶性FasL等,2.线粒体激活途径(死亡受体非依赖的凋亡途径)：在凋亡诱导信号作用下，线粒体膜受损，释放Cyt.c进入胞浆与Apaf-1、ATP和caspase9形成凋亡复合物，最后使caspase3激活。,线粒体介导凋亡的机制Cyto-CApaf-1procaspase-9caspase-9AIFCyto-C凋亡的信号核酸内切酶Smac/Dia
11、blo凋亡抑制蛋白,细胞凋亡的主要信号转导通路,线粒体通路,死亡受体通路,（三）凋亡相关基因,目前发现与细胞凋亡有关的基因有3类:促进、抑制、协助细胞凋亡基因,（1）Bcl-2家族：有抗凋亡基因如Bcl-2、Bcl-XL，促凋亡基因如Bax、Bak等成员。Bcl-2(B淋巴细胞瘤基因)是哺乳动物中发现的第一个与线虫ced-9同源的、能抑制细胞凋亡的原癌基因。Bcl-2蛋白主要分布于细胞膜系统，Bcl-2的高表达可防止多种诱导因素引起的细胞凋亡。抗与促凋亡的成员相互作用如Bax、Bik（图）决定其凋亡阈值。 除去 NGF NGF神经细胞细胞凋亡 转染Bcl-2神经细胞凋亡 淋巴细胞性白血病病人：
12、Bcl-2阳性20,Bcl-2抗凋亡的主要机制: 直接抗氧化作用； 抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质:Cyt.c、AIF 抑制促凋亡调节蛋白Bax、Bak的作用； 抑制caspase的激活：Bcl-2能够结合和灭活Apaf-1，阻断对caspase-9活化；也能特异地结合Cyt.c 。 维持细胞钙稳态。,Bcl-2作用机制示意图：,（2）p53基因：wtp53诱导细胞凋亡，通过细胞凋亡抑制肿瘤的生长；而mtp53则可抑制细胞凋亡。wtp53编码蛋白是一种DNA结合蛋白，它能在细胞G1期发挥检查功能，DNA受损伤则修复，修复失败则促使细胞凋亡。 wtp53被称为“分子警察”，对机体起保护作用。,wt
13、P53,“分子警察”,?,周期素依赖性激酶(CDK)抑制因子,（3）c-myc和Bcl-x ：c-myc为癌基因，其编码的蛋白为重要的转录调节因子，既可激活介导细胞增殖的基因，也可激活介导细胞凋亡的基因。,Bcl-x基因可翻译出两种蛋白Bcl-XL和Bcl-XS，前者抑制细胞凋亡，后者促进细胞凋亡。,细胞凋亡的生理意义：1、确保正常生长、发育 胚胎发育过程中，指（趾）间组织通过细胞凋亡形成指（趾）间隙。2、维持内环境稳定 受损、突变、衰老的细胞以及针对自身抗原的T细胞、癌前病变细胞等大多通过细胞凋亡清除。3、防御功能 被病毒感染的细胞通过细胞凋亡、使DNA降解，阻止病毒复制。,细胞凋亡与疾病,
14、细胞凋亡与疾病,细胞凋亡不足与过度并存,“该死的细胞没死”,“不该死的细胞死了”,一、细胞凋亡不足(一)肿瘤：肿瘤的发生、发展及转移与肿瘤细胞凋亡不足与都有关。bcl-2基因过表达：如B细胞淋巴瘤、神经母细胞瘤、白血病、前列腺癌和结肠癌等存在Bcl-2高水平表达。（图）p53基因缺失或突变：wtp53、mtp53(非小细胞肺癌p53突变率达50%)；,肿瘤细胞凋亡不足的可能机制调控凋亡相关信号的异常：包括促凋亡信号（如TNF和Fas）和抑凋亡信号（如EGF）的异常。(乳腺癌图)诱导凋亡相关信号转导通路的障碍：包括死亡受体和线粒体介导的相关信号转导通路异常。乳腺癌组织中Fas受体表达降低；乳腺癌
15、组织中Fas与癌细胞凋亡率呈正相关。实施凋亡相关基因表达的异常：包括抑凋亡基因和促凋亡基因的异常，尤其是Bcl-2和p53。 mtp53则肿瘤的发生率增高。执行凋亡相关酶活性的异常: 包括caspase和核酸内切酶等活性异常。 Caspase活性下降，则瘤细胞凋亡明显下降。,(二)病毒感染性疾病 正常时宿主可利用细胞凋亡介导感染病毒的细胞自杀。但病毒及其产物抗凋亡的可能机制有：灭活P53：腺病毒的基因表达EIB55kD蛋白和EIB19kD蛋白都可结合P53；高表达Bcl-2：EB病毒的产物潜伏蛋白(LMP)能特异性上调Bcl-2，防止B细胞凋亡。,(三)自身免疫性疾病T细胞的正、负选择理论：正
16、选择：与非已抗原-MHC抗原结合的TCR的单阳性细胞保留存活，进入外周T细胞库。负选择：与自身抗原-MHC抗原结合的TCR的双阳性细胞通过细胞凋亡被清除。负选择失调多发性硬化症、胰岛素依赖性糖尿病、慢性甲状腺炎、SLE,自身免疫性疾病：由于细胞凋亡不足，未能有效清除自身免疫性T细胞所致。糖皮质激素对这类病的治疗就是其诱导了自身免疫性T细胞凋亡。,(一) AIDS发病 人体HIV感染后引起的,以CD4+T细胞被选择性破坏，导致其数量显著下降，相关免疫功能缺陷。其机制：1.宿主细胞CD4+有gp120表达，可与CD4+结合线粒体途径；gp120与病毒蛋白(Vpr)结合G2期阻滞。2.CD4+淋巴细
17、胞Fas基因表达上调死亡受体途径；3.受染的巨噬细胞分泌TNF与死亡受体结合诱导凋亡；受染的CD4+分泌氧自由基内质网应激(ERS)诱导凋亡；,二、细胞凋亡过度,4.受染的CD4+ 产生Tat蛋白(反式激活蛋白)进入CD4+细胞 诱导氧自由基产生并增强Fas表达；5.受激活的T淋巴细胞促使受染的CD4+ 产生激活诱导的细胞死亡(AICD)；(缺乏细胞因子)6.合胞体细胞形成后加速受染的CD4+凋亡；7.慢性时，受染的CD4+作为效应细胞攻击未受HIV感染的CD4+ 细胞 引发CD4+凋亡(Tat蛋白的诱导)；,(二)心血管疾病,心肌缺血、缺血-再灌注损伤心力衰竭:细胞凋亡则是数量减少的重要因素
18、发生凋亡的常见现象： 缺血早期 梗死灶周边部分 慢性轻度的心肌缺血凋亡发生的机制： 氧化应激氧自由基 死亡受体Fas显著上调 mtp53基因激活转录加速,(三)神经元退行性疾病 阿尔茨海默病(AD) 、Parkinson disease、MS等。,AD发病机制：-淀粉样蛋白（A）、钙超载、氧化应激及神经生因子分泌不足等因素使神经元凋亡。如氧自由基作用于神经元钙超载激活A合成的基因使神经元内A合成增多 引起凋亡。1.Fas抗原的介导星形神经细胞凋亡；2.Fas基因的活化介导神经胶质细胞凋亡；3.c-Jun和c-foc及其编码蛋白的作用；海马细胞凋亡4.APP695基因突变的作用；5.低亲和力神经
19、生长因子受体（P75NGFR）高表达；6.NF-B的活化: -淀粉样物质产生活性氧而活化的。,三、细胞凋亡不足与过度并存,动脉粥样硬化：内皮细胞凋亡过度，平滑肌细胞凋亡相对不足。酒精性肝硬化：肝细胞凋亡过度，间质纤维细胞凋亡不足。,合理利用凋亡相关因素低剂量射线照射、TNF、高温；NGF可抑制AD的发生、去势可抑制前列腺癌。干预凋亡信号转导 阿霉素Fas/FasL表达死亡受体介导通路 治疗肿痛 ；环胞霉素A阻止m、PTP开放CytoC线粒体介导通路治疗AD。调节凋亡相关基因恢复“分子警察”（wtp53）的作用；基因封条(反义DNA形成DNA-mRNA杂交链)抑制Bcl-2表达。控制凋亡相关的酶
20、学机制减少或抑制(Zn2)核酸内切酶、凋亡蛋白酶的激活,与APO有关的疾病的防治,TC获得了在识别过程中自身MHC的限制能力。,TC库中不含有针对自身成分的TC,核小体是染色质的基本结构单位，由核小体形成的串珠链就是染色体的一级结构。,螺线管是染色体的二级结构。,超螺线管是染色体的三级结构。,凋亡的主要变化,1. 凋亡时细胞的形态学改变,微绒毛消失,空泡化,固缩,出芽,边集,凋亡小体,blebbing,condensation,budding,margination,apoptosis body,脱水,Caspase激活,procaspase被激活的过程相似，即通过功能区间特异位点的蛋白酶解，继而以大小亚单位形式形成异源二聚体，进一步形成四聚体（caspase活化）,死亡受体激活途径,Bcl-xl抑制和Bik促进凋亡的作用,Cyt.c+Apaf,细胞凋亡的主要信号转导通路,Bcl-2基因在不同类型的肿瘤中过度表达的频率(%),肿瘤类型 Bcl-2基因过度表达频率(%) 结肠-直肠癌 92 咽 癌 85 骨 髓 癌 80 乳 腺 癌 70 非何杰金淋巴瘤 65-70 胃 癌 60-70 前列腺癌 30-60 神经母细胞瘤 30-35 肺癌(小细胞肺癌) 20(80),
