1、免疫组化与细胞形态学研究,免疫组织细胞化学（理论10学时、实验30学时）,理论30分,实验70分,出勤率 10笔 记 10开卷考试 10,实验表现 20实验结果 30实验报告 20,总成绩,100分,参考书：,主要内容,第一节 免疫组织化学的定义第二节 免疫组织化学中的免疫化学第三节 组织细胞的处理第四节 免疫组织化学染色的原理和方法第五节 免疫组织化学技术的实际应用,组织学:体内结构为立体的，三维的，而课本、讲义和显微镜下的结构均为平面的，二维的。,a. 最常用的染料是苏木素(Hematoxylin, H)和伊红(Eosin, E)。* 苏木素是碱性染料，蓝紫色，可以使细胞核等着色。被苏木素
2、着色的结构本身为酸性，具有嗜碱性(Basophilic)。,石蜡切片,* 伊红是酸性染料，粉红色。可以将大多数细胞的细胞质染成红色。被伊红着色的结构本身为碱性，具有嗜酸性(Acidophilic)。* 不易被苏木素和伊红着色的结构具有嗜中性(Neutrophilic)。,肥大细胞的颗粒被甲苯铵蓝(一种蓝色染料)染成紫红色b. 如果某结构显示的颜色和染料本身的颜色不同，该结构具有异染性(Metachromasia)。c. 如果某结构能将银离子还原成银原子，并吸附银原子而使自身显示棕黑色，该结构具有嗜银性(Argyrophilic)。,H&E染色的中等动静脉d. 不同的染色方法，其结果不同。,醛复
3、红染色的中等动静脉,网状纤维具有嗜银性，因此可以用银盐染色来显示。,第一节 免疫组织化学的定义,一、组织化学（Histochemistry）,是建立在组织和细胞内化学成分不同的基础上，运用染色的方法区分出胞质、胞核和细胞外基质，从而显示出组织和细胞的形态。,第一节 免疫组织化学的定义,通过生物化学的方法在原位产生不溶解的有颜色的反应产物，来显示微细结构的位置，然后用显微镜观察。,一、组织化学（Histochemistry）,组织化学源于组织学、细胞学和生物化学，又不同于这些学科。,第一节 免疫组织化学的定义,一、组织化学（Histochemistry）,组织学、细胞学：研究形态结构组织化学：化
4、学组成含量，酶的存在及活性,第一节 免疫组织化学的定义,组织化学源于组织学、细胞学和生物化学，又不同于这些学科。,一、组织化学（Histochemistry）,第一节 免疫组织化学的定义,生物化学：破坏细胞，定位性差组织化学：原位显示，定位性强,组织化学源于组织学、细胞学和生物化学，又不同于这些学科。,组织化学,二、免疫组织化学（Immunohistochemistry，ICC）,第一节 免疫组织化学的定义,免 疫 学,免疫组织化学,立足于组织和细胞内的某些化学物质或结构成分能够作为抗原，用相应的特异性抗体孵育组织切片，抗体与切片中的相应抗原特异性结合，形成抗原抗体复合物，在显微镜下观察此复合
5、物存在的位置和数量，确定出抗原在组织和细胞中的定位和定量。,二、免疫组织化学（Immunohistochemistry，ICC）,第一节 免疫组织化学的定义,二、免疫组织化学（Immunohistochemistry，ICC）,第一节 免疫组织化学的定义,抗原,抗原抗体复合物,镜 检,标记的特异性抗体,定义：免疫组织化学又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测的技术。,二、免疫组织化学（Immunohistochemistry，ICC）,第一节 免疫组织化学的定义,三、免疫组织化学的发展简史,第一节 免疫组织化学的
6、定义,1941年 Coons 实用免疫荧光技术。60年代 Nakane建立酶标抗体技术。1981年 Hsu 建立了 ABC 法。90年代分子杂交、原位杂交、原位PCR法迅速发展2000年各种免疫组化技术更加成熟，成为生命科学工作者必须掌握的基本技术之一。,A cell-labeling technique called DiOlistics,invented by postdoctoral fellows Wen-Biao Gan, PhD, and Jaime Grutzendler, PhD, and faculty members Rachel O.L. Wong, PhD, and J
7、eff W. Lichtman, MD, PhD - distinguishes individual cells in the brain using seven different colors.,Stylonychia mytilus,AZM、UM、FC,Stylonychia mytilus,Paramecium caudatum,Paramecium caudatum,Stylonychia mytilus,四、免疫组织化学的优点及应用,第一节 免疫组织化学的定义,1.特异性强2.灵敏度高3.定位准确,优点,组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、受体、表面抗原等均可用免
8、疫组织化学方法显示，在基础与临床科研中广泛应用。,四、免疫组织化学的优点及应用,第一节 免疫组织化学的定义,第二节 免疫组织化学中的免疫化学,一、抗 原（antigen，Ag）,第二节 免疫组织化学中的免疫化学,1.抗原的定义 能够刺激机体产生免疫反应的物质2.抗原的两种特性: 免疫原性 -能刺激机体产生相应的抗体 免疫反应性-可与相应的抗体发生特异性结合,二、抗 体（antibody ，Ab ）,第二节 免疫组织化学中的免疫化学,1.抗体的定义： 是机体在抗原物质刺激下形成的一类能与抗原特异性地结合的球蛋白，称免疫球蛋白。,二、抗 体（antibody，Ab）,第二节 免疫组织化学中的免疫化
9、学,2.抗体的标记：,必要性：组织细胞内AgAb结合反应一般是不可见的，若在镜下检测，必须具有可视性标记物。标记物：荧光素、酶、铁蛋白、胶体金和放射性同位素等,2.抗体的标记：, 荧光素标记：,在抗体上标记荧光素，经特定波长的光照射激发后能够发出荧光，借此定位观察和追踪。 最常用：异硫氰酸荧光素 (Fluorescein Isothiocyanate, FITC)，紫外线激发下产生翠绿色荧光。,2.抗体的标记：, 酶标记：,以酶作为标记物与外加的底物作用产生不溶性色素，沉积于抗原抗体反应的部位。 常用：辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）和碱性磷酸酶（alk
10、aline phosphatase, AP）,生物素,2.抗体的标记：, 生物素标记：,生物素：又称维生素H，一种小分子维生素抗生物素：又称卵白素或亲和素，对生物素具很强的结合力。两者即可与抗体偶联，又可被酶标记,生物素,抗生物素,生物素-抗生物素系统一端偶联大分子生物反应体系，另一端连结标记物，后者加入酶的底物，产生颜色反应。,去除抗体溶液中不需要的杂有成分，提高标记抗体的特异性，减少背景染色。,二、抗 体（antibody，Ab）,第二节 免疫组织化学中的免疫化学,3. 标记抗体的纯化：,4.标记抗体的质量评估和保存：,目前我们试验所用的抗体大多由试剂公司（SIGMA、SANTA等）直接购
11、买,第三节 组织细胞的处理,第三节 组织细胞的处理,标本制备恰当，是免疫组化成功的首要条件免疫组化对组织和细胞标本的要求：保持标本原有的结构、形态；在原位保持待测抗原的免疫活性；根据抗原含量及特性选择最佳实验方法。,一、取材二、固定三、脱水四、透明,第三节 组织细胞的处理,五、透入与包埋,六、切片,七、贴片与烤片,免疫组化中常用的组织和细胞标本,第三节 组织细胞的处理, 细胞标本,组织印片细胞培养片细胞悬液涂片,石蜡切片冰冻切片, 组织标本,一、取材,第三节 组织细胞的处理,一、取材,将洁净载玻片轻压于已暴露的新鲜组织切面，细胞即粘附于玻片，晾干后固定，自然干燥后染片或-20保存。,组织印片,
12、（一）细胞标本的取材,p53免疫组化结果, 胃热伤阴型, 腺癌II级, +, 100,第三节 组织细胞的处理,一、取材,贴壁细胞培养时，置盖片于培养瓶中，使细胞在盖片上生长，达适当密度后取出固定，再染色。,细胞培养片,（一）细胞标本的取材,第三节 组织细胞的处理,探讨是否能够从低温保存的流产儿分离培养出脊髓神经干细胞,第三节 组织细胞的处理,一、取材,手涂法 将细胞直接涂于载玻片上，均匀不重叠。涂片机涂片法 将细胞样品制成细胞悬液，加入涂片机内离心。,细胞悬液涂片,（一）细胞标本的取材,第三节 组织细胞的处理,一、取材,细胞悬液涂片,（一）细胞标本的取材,海马神经元内11-HSD1与GR的免疫
13、细胞化学染色GC可以促进海马神经元11-HSD1的表达, 此作用是否与GR介导的基因机制有关 糖皮质激素代谢酶11-羟基类固醇脱氢酶型(11-HSD1)和糖皮质激素受体(GR)在大鼠海马神经元内的共同分布及其意义。用免疫细胞化学方法研究显示, 海马神经元内不仅存在11-HSD1免疫反应物质, 还存在GR免疫反应物质, 而且11-HSD1与GR共存于同一个海马神经元内,第三节 组织细胞的处理,一、取材,1.动物处死的要求： 迅速处死，避免因痛苦产生组织细胞的变形2.动物处死的方法 麻醉（乙醚、氯仿、4%戊巴比妥、20%氨基甲酸乙脂） 击头、颈椎脱臼、毁脑和脊髓 股动脉放血、空气栓塞法,（二）组织
14、标本的取材,3. 取材的注意事项,（二）组织标本的取材,1）处死后立即取材。2）刀片锋利，维持原形。3）取材力求小而薄。4）详细记录材料名称及取材时间。,第三节 组织细胞的处理,一、取材,第三节 组织细胞的处理,二、固 定,（一）固定的目的,1.终止酶的活性，防止自溶。2.维持原有形态。3.硬化组织，便于切片。,第三节 组织细胞的处理,二、固 定,（二）固定的注意事项,1.取材后迅速固定2.选取适宜的固定剂3.固定液的用量（固定液：材料=20：1）4.固定的时间（取决于组织块的大小、部位、固定液的渗透力及温度）5.铅笔做标签（材料名称、固定液及时间）,（三）理想的固定剂需具备的条件：,1.迅速
15、渗入材料。2.使细胞不致因固定引起人为的改变。3.对组织各部分渗透力相等，使组织内外完全固定。4.尽可能避免组织膨胀或收缩。5.增加细胞内含物的折光程度和染色能力。6.使组织变硬，适于切片，但又不至于太硬而松散。7.固定以后又有保存作用。,（四）常用固定剂的优缺点：,固定浓度：固定时间：固定后处理：配制方法：特性：渗透力强，组织收缩少。易氧化,10%水溶液12-24h流水冲洗12-24h甲醛原液10-20ml+蒸馏水90-80ml,1.甲醛,（四）常用固定剂的优缺点：,固定浓度：固定时间：固定后处理：配制方法：特性：兼有硬化和脱水作用。很少单独使用。,80-95%乙醇取决于组织大小及乙醇浓度4
16、-12h直接入脱水剂无水乙醇80-90ml+蒸馏水10-20ml,2.乙醇（酒精）,（四）常用固定剂的优缺点：,配制方法：固定时间：固定后处理：,无水乙醇或95%乙醇（A）90ml+甲醛原液（F）10ml组织块4-12h，铺片5-10min直接入脱水剂脱水,3.A-F液（乙醇-甲醛溶液）,（四）常用固定剂的优缺点：,配制方法：固定时间：固定后处理：,饱和苦味酸75ml+40%甲醛25ml+冰乙酸5ml12-24h70%酒精洗去苦味酸的黄色,4.Bouin液,（四）常用固定剂的优缺点：,配制方法：固定时间：固定后处理：,冰乙酸10ml+氯仿30ml+无水乙醇60ml20-40min，较大材料不超
17、过2-4h直接入脱水剂脱水,5.Carony液,（四）常用固定剂的优缺点：,6.戊二醛-多聚甲醛缓冲液,配制方法：固定后处理：应用：,4%多聚甲醛磷酸缓冲液中加入0.5-1%戊二醛磷酸缓冲液水洗免疫电镜,（四）常用固定剂的优缺点：,7.升汞,固定浓度：固定时间：固定后处理：特性：,5-7%水溶液不超过24h碘酒溶液脱汞剧毒,（四）常用固定剂的优缺点：,水溶液中性，淡黄色结晶固定蛋白质均匀，不使细胞收缩对胞质固定很好，而核则固定不好。优点：穿透速度慢，可保持组织柔软，防止硬化缺点：固定不均匀，表面过度以致于难于染色。深部没有固定，仅中部才适宜。有毒。,8.锇酸（四氧化锇）1-2%双蒸水溶液,（五
18、）固定的方法：,1浸入法：将组织浸在固定液内，必要时可在低温（4 ）环境下进行，固定时间根据抗原的稳定性以及固定液性质而定，一般2-12h之间。2灌注法：适用于动物实验研究。自左心室插入主动脉，先以生理盐水冲冼血液后，注入固定液。置灌注动物于4冰箱内，次日取出脑组织或其它组织。外周组织一般在灌注后30min内取材，取组织置同一固定剂中浸入1-3h。,第三节 组织细胞的处理,三、脱 水,（一）脱水的目的,组织经固定及水洗后含有大量水分，因水不能与石蜡混合，故需用脱水剂将组织中的水分置换出来。,第三节 组织细胞的处理,三、脱 水,（二）脱水剂类型,常用：酒精、丙酮等。,必须是与水在任何比例下都可混
19、合的液体,第三节 组织细胞的处理,三、脱 水,（三）酒精脱水的注意事项,1.逐级脱水（50%、70%、85%、95%、100%、100%）2.为彻底脱水走两次纯酒精3.70%酒精可长期保存材料4. 脱水时间适宜。 低浓度酒精中不宜过久，否则变软，甚至促进分解。 高浓度酒精中也不宜过久，否则收缩、变脆，切片困难。5.低温脱水,第三节 组织细胞的处理,四、透 明,（一）透明的目的,共有两次透明过程： 1.在浸蜡前、脱水后的透明过程。 将脱水剂换成透明剂而有利于石蜡浸入。 2.切片染色后脱水再次透明。 有利于封固剂的透入。 使光线均匀透过切片，有利于观察。,第三节 组织细胞的处理,四、透 明,（二）
20、常用的透明剂,1.二甲苯： 最常用的透明剂，溶于酒精和石蜡。能与封固剂树胶混合。透明力强，作用较快。 缺点：易使组织收缩变脆，此步不可久留，略带酸性，略有褪色作用。,第三节 组织细胞的处理,四、透 明,（二）常用的透明剂,二甲苯透明过程：,100%酒精脱水后1/2二甲苯+1/2纯酒精 纯二甲苯,用二甲苯完全置换出酒精,第三节 组织细胞的处理,四、透 明,（二）常用的透明剂,2.氯仿优点：毒性低，材料收缩不太强烈，易挥发。缺点：能破坏染色。渗透力稍弱，需适当延长时间，比重大，易使材料漂浮,第三节 组织细胞的处理,五、透入与包埋,（一）透入的目的,除去组织中的透明剂而代之以石蜡，使石蜡渗入组织内部
21、后把软组织变为适当硬度的蜡块，以便切成薄片。,第三节 组织细胞的处理,五、透入与包埋,（二）透入包埋剂（石蜡）,6062时，用液态石蜡完全置换出二甲苯。室温时石蜡凝固成固态，内含待切组织。,第三节 组织细胞的处理,五、透入与包埋,（二）透入包埋剂（石蜡）,（三）浸蜡与包埋过程中的注意事项,石蜡太硬切片时容易破碎，不易切成蜡带； 石蜡太软则使蜡带皱缩，贴片时很难排平。2. 新蜡使用前应先在浸蜡箱中融化，赶走气泡，旧蜡可重复利用，效果比新蜡好。3. 包埋时注意材料的方向性4. 带二甲苯的旧蜡统一回收，不带二甲苯的旧蜡回收后再利用。5. 不用烫镊子夹材料，防止蜡带带静电。6. 做好标签。,第三节 组
22、织细胞的处理,六、切片,（一）切片机,第三节 组织细胞的处理,六、切片,1.切片平整2.连续切片3.贴片牢固4.根据研究目的，调整切片厚度。,（二）切片的注意事项,1. 蜡带不直：修蜡块时不平行2. 不能切成连续蜡带：切片刀不锋利或刀口与蜡块的角度不适合。3. 蜡带皱缩：石蜡太软或切片时室温过高，可用冷水浸蜡块。切片太薄。刀口与蜡块角度154. 蜡带有静电不成带：包埋时温度高烫了材料，不易纠正5. 蜡带翻上不成带：石蜡硬，刀角不适当。6.盛蜡带的纸盘一定要干净。,（三）切片时常见技术问题的处理,新载玻片清洗法： 热洗衣粉水洗自来水冲洗蒸馏水盐酸酒精过夜自来水冲洗 蒸馏水70%酒精擦净装盒备用,
23、第三节 组织细胞的处理,七、贴片与烤片,（一）载玻片、盖玻片的清洗,盐酸酒精的配制： 95%酒精9份+浓盐酸1份,旧载玻片清洗法： 洗衣粉水煮沸20-30分钟，搅动去掉盖玻片，每片洗净再按上述方法进行。,第三节 组织细胞的处理,七、贴片与烤片,（一）载玻片、盖玻片的清洗,盖玻片清洗法； 逐片投入到95%酒精中浸泡过夜擦净备用。,第三节 组织细胞的处理,七、贴片与烤片,（二）常用的贴片剂,APES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）Polv-L-Lysine（多聚赖氨酸）铬明胶溶液,石蜡组织切片中抗原性的修复,#抗原修复的原因 前期处理过程使蛋白大分子内或分子间发生交联，从而屏蔽抗原决定簇或使其三维结构的
24、构象发生改变。 染色时需先进行抗原修复或暴露，将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。,石蜡组织切片中抗原性的修复,修复的方式： 胰蛋白酶 微波照射 高压加热法 水浴加热法,第四节免疫组化染色的原理及方法,按抗体标记物的性质分成： 免疫荧光法 免疫酶法 亲合免疫组化等,免疫组织化学的技术分类,第四节 免疫组织化学染色原理和方法,常用的标记荧光素：,一、免疫荧光法,第四节 免疫组织化学染色原理和方法,1.直接法 抗原+荧光素标记的第一抗体荧光显微镜检测 简单，特异性强，灵敏度低 应用：基本不用了！,一、免疫荧光法,第四节 免疫组织化学染色原理和方法,2.间接法,一、免疫荧光法
25、,抗原+第一抗体+荧光素标记的第二抗体镜检,2.间接法,抗原,2.间接法,一抗,抗原,因信号被放大，因此更加敏感。应用：常用,2.间接法,一抗,抗原,荧光素标记的二抗,例：,一、免疫荧光法,人催乳素,兔,羊抗兔抗体（二抗）,间接法的标记抗体适用范围广,荧光显微镜,荧光显微镜（倒置）,激光扫描共聚焦显微镜,第四节 免疫组织化学染色原理和方法,一、免疫荧光法,直接法间接法,第四节 免疫组织化学染色原理和方法,二、免疫酶法,第四节 免疫组织化学染色原理和方法,原理： 以酶作为标记物与外加底物作用产生不溶性的色素，沉积于抗原抗体反应部位。 应用较广,二、免疫酶法,色有色产物,第四节 免疫组织化学染色原
26、理和方法,二、免疫酶法,（一）酶标记抗体法（酶标法）,色有色产物,第四节 免疫组织化学染色原理和方法,抗原+ HRP酶标抗体抗原-抗体-HRP复合物,二、免疫酶法,1. 直接法,（一）酶标记抗体法（酶标法）,色有色产物,第四节 免疫组织化学染色原理和方法,抗原-抗体-HRP复合物+底物与显色剂,二、免疫酶法,1. 直接法,（一）酶标记抗体法（酶标法）,（ DAB-H2O2 ）,简单，特异性强，灵敏度低，少用！,色,第四节 免疫组织化学染色原理和方法,抗原+第一抗体+酶标第二抗体+( DAB-H2O2),二、免疫酶法,2. 间接法（常用）,（一）酶标记抗体法（酶标法）,色有色产物,第四节 免疫组
27、织化学染色原理和方法,二、免疫酶法,（二）非标记抗体酶法,动物,色有色产物,第四节 免疫组织化学染色原理和方法,二、免疫酶法,1. 酶桥法,（二）非标记抗体酶法,动物,桥抗体,色有色产物,第四节 免疫组织化学染色原理和方法,抗原+抗体+二抗(桥抗体)+抗酶抗体+HRP+(DAB-H2O2),二、免疫酶法,1. 酶桥法,（三抗）,（二）非标记抗体酶法,色有色产物,第四节 免疫组织化学染色原理和方法,抗原+抗体+二抗(桥抗体)+抗酶抗体+HRP+(DAB-H2O2),二、免疫酶法,1. 酶桥法,（三抗）,抗体未经酶标记 三抗对抗原具有二次放大作用，比间接法敏感。,（二）非标记抗体酶法,2. PAP
28、法（酶-抗酶免疫复合物法）： (Peroxidase-anti-peroxidase complex),第四节 免疫组织化学染色原理和方法,二、免疫酶法,（二）非标记抗体酶法,PAP复合物稳定，不易脱落，灵敏度高。,PAP法反应原理：抗原+一抗+二抗+PAP复合物+DAB-H2O2显色液,DAB-H2O2,生物素,第四节 免疫组织化学染色原理和方法,三、亲合免疫组化,生物素抗生物素（亲合素、卵白素）两者能和酶、抗体结合,生物素,第四节 免疫组织化学染色原理和方法,三、亲合免疫组化,LAB法（标记抗生物素-生物素法） (Labelled avidin-biotin method),用酶标记抗生物
29、素用生物素标记抗体,LAB法反应原理：抗原+一抗+生物素标记的二抗+酶标抗生物素+DAB-H2O2显色液,灵敏度高，特异性强，简洁。,生物素,第四节 免疫组织化学染色原理和方法,三、亲合免疫组化,BAB法（桥连抗生物素-生物素法） (Bridged avidin-biotin method),用酶标记生物素用生物素标记抗体,BAB法反应原理：抗原+一抗+生物素标记的二抗+抗生物素+酶标生物素+DAB-H2O2显色液,生物素,第四节 免疫组织化学染色原理和方法,三、亲合免疫组化,ABC法（抗生物素-生物素-酶复合物法） (Avidin-biotin-peroxidase complex meth
30、od),ABC复合物：生物素+酶+抗生物素,ABC法反应原理：抗原+一抗+生物素标记的二抗+ABC复合物+DAB-H2O2显色液,灵敏度高，特异性强，简洁。,四、双重或多重免疫组化,第四节 免疫组织化学染色原理和方法,在同一标本上同时或先后显示两种或两种以上的抗原，光镜下根据不同颜色判断不同的抗原成分。,1.双重荧光染色2.双重酶染色,五、非特异性着色,第四节 免疫组织化学染色原理和方法,染色过程中产生的非靶抗原的着色结果，属假阳性，又称背景着色。应尽量减少或消除。,六、对照的设置,第四节 免疫组织化学染色原理和方法,1.阳性对照： 用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行染色。对照片结果呈阳性
31、。,六、对照的设置,第四节 免疫组织化学染色原理和方法,2.阴性对照：阴性标本对照：用确证不含已知抗原的标本作对照，结果呈阴性。,六、对照的设置,第四节 免疫组织化学染色原理和方法,2.阴性对照：空白对照：用缓冲液取代第一抗体进行试验，结果为阴性。,六、对照的设置,第四节 免疫组织化学染色原理和方法,2.阴性对照：吸收试验：特异性第一抗体用相应的纯化抗原中和吸收，其结合位点全部被外源性抗原结合，不能再与组织内的靶抗原反应，用这种吸收后的第一抗体做免疫染色，结果为阴性。,六、对照的设置,第四节 免疫组织化学染色原理和方法,2.阴性对照：抑制试验：用未标记抗体与标记抗体先后与标本反应，未标记抗体起
32、到封闭抗原的作用。染色结果减弱或转阴。,3.染色实验组与对照组结果分析表,第四节 免疫组织化学染色原理和方法,六、对照的设置,1. 全部切片均为阴性的原因： 染色未完全严格按照操作步骤进行； 漏加一种抗体，或抗体失效； 底物中所加H2O2 量少或失效；,七、染色失败的几种原因,第四节 免疫组织化学染色原理和方法,七、染色失败的几种原因,第四节 免疫组织化学染色原理和方法,2.全部切片均为阳性的原因： 染色过程中抗体过浓，或切片干燥了。 缓冲液洗涤不彻底。 使用已变色的显色底物溶液，或显色时间过长。 抗体孵育时间过长。 H2O2 浓度过高，呈色速度过快。,以石蜡切片为例写出组织细胞处理的过程,主
33、要内容,第一节 免疫组织化学的定义第二节 免疫组织化学中的免疫化学第三节 组织细胞的处理第四节 免疫组织化学染色的原理和方法第五节 免疫组织化学的实际应用,第五节 免疫组织化学的实际应用,第五节 免疫组织化学的实际应用,题目： 家鸡消化道内5-HT细胞的免疫组织化学定位,家鸡消化道内5-HT细胞的免疫组织化学定位,实验目的 本实验拟对家鸡消化道5-HT细胞进行鉴定和定位研究。,实验材料：实验方法：结果：讨论：,3.实验方法,3.1石蜡切片的制备,3.1.1.取材：用绳系于家鸡颈部，窒息死亡。,3.实验方法,3.1.1取材：剖开体腔,3.1.1.取材： 取消化道各段：食管、嗉囊、腺胃、十二指肠、
34、空回肠、盲肠和直肠。 取材大小：0.5cm,3.实验方法,3.1.2.固定： 用生理盐水洗净后，投入改良的Bouins液中固定12-24h过夜。,3.实验方法,3.1.3.保存： 将固定液倒出，固定后的组织用70%酒精洗2次。可在70%酒精中暂时保存。,3.实验方法,3.1.4.脱水：梯度酒精脱水,80%乙醇 3 h90%乙醇 3 h95%乙醇I 2 h95%乙醇II 2 h无水乙醇I 2 h无水乙醇II 2 h,3.实验方法,3.1.5.透明： 1/2无水乙醇+1/2二甲苯 2 h（可过夜） 二甲苯I 2 h 二甲苯II 2 h,3.实验方法,3.1.6.浸蜡：选取熔点为60的石蜡首先在60
35、条件下熔解石蜡,烘 箱,3.实验方法,3.1.6.浸蜡：在60条件下进行1/2二甲苯+1/2石蜡 2 h纯石蜡I 2 h纯石蜡II 2 h,3.实验方法,3.1.7.包埋：将液体石蜡倒入包埋筐内，放入标签，贴着筐壁，字向外，用酒精灯加热镊子，用镊子搅动筐中央稍有些凝固的石蜡，将材料放入筐中央部位。室温下凝固变硬成蜡块,3.1.8.切片：把包埋好的蜡块用刀片修切成正方形或长方形，注意勿太靠近组织，让组织四周留有少许石蜡。蜡块两边必须切成平行的直线，以免切下的蜡条弯曲。,3.1.8.切片：将上表面放有碎石蜡的手术刀在酒精灯上加热。将熔好的蜡液涂在木块上表面。再次加热刀片，将刀片放于木块与蜡块之间，
36、使蜡块下表面及木块上表面的蜡熔化后，迅速抽出刀片，蜡块即粘于木块上。用加热的刀片将蜡块与木块接触的四个边缘稍熔，用手指按压以加固。,3.1.8.切片： 将刀和木块固定在切片机上。调整刻度指针到要求的厚度，一般要求58微米。切片刀要拭净。用右手摇切片机转轮，左手持毛笔托住蜡带。匀速转动转轮。均匀切片。切好的蜡带，放在切片盒内（或纸上）。,用刀片将其每4-5片分成一段。用无水乙醇将展片台擦净，使温度保持在比包埋石蜡的熔点低5-6，如包埋石蜡的熔点为60，则展片台宜在55左右。温度过低，展片费时过长；温度过高，石蜡熔化。,切好的蜡带,切片盒,3.1.9.贴片、展片：,在预先用明胶处理过的载玻片一端滴
37、二滴经煮沸去气泡的蒸馏水。用小镊子夹取一段蜡带，使浮在玻片的水上，摆正位置（一般稍偏于玻片的一端，留下贴标签位置）。然后把玻片放在展片台上，蜡带受热即自动展开，也可用解剖针轻轻拉开。倾斜载片，用吸水纸吸去多余水分。注意切片和载玻片之间不能有气泡，否则在展片时气泡会扩大，影响以后镜检。,3.1.9.贴片、展片：,标签,37展片台上烘片24h以上将片子移入载片盒，放入37 恒温箱内24h。处理好的片子放入4 冰箱中备用。可保存1-2个月,3.1.9.贴片、展片：,标签,标签,标签,3.2 免疫组织化学染色：,3.2.1.脱蜡、复水：,二甲苯I 二甲苯II 1/2二甲苯+ 1/2无水乙醇无水乙醇I
38、无水乙醇II 95%乙醇I95%乙醇II90%乙醇80%乙醇70%乙醇双蒸水I双蒸水II,3.2免疫组织化学染色：,每级各35 min,每级各35 min。,二甲苯I,二甲苯II,1/2二甲苯+ 1/2无水乙醇,无水乙醇I,无水乙醇II,95%乙醇I,95%乙醇II,90%乙醇,80%乙醇,70%乙醇,双蒸水I,双蒸水II,3.2.1.脱蜡、复水：,3.2.2. 用蜡笔在载片上画蜡圈,3.2免疫组织化学染色：,标签,3.2.3. 加3% H2O2溶液37孵育15 min，消除内源性过氧化物酶的活性。,标签,3.2免疫组织化学染色：,3.2.4. 双蒸馏水浸洗5 min，PBS浸洗5 min。,
39、双蒸馏水,PBS,3.2免疫组织化学染色：,以下步骤均在湿盒中进行：3.2.5. 从PBS中取出切片，用滤纸吸去多余水分后，滴加正常羊血清（3：200），放入孵育湿盒内，室温孵育20 min。,标签,3.2免疫组织化学染色：,3.2.6. 弃去多余血清，滴加1：100稀释的第一抗体，放入孵育湿盒内，室温过夜。,标签,3.2免疫组织化学染色：,PBS,3.2.7. PBS冲洗3次，每次5 min。,3.2免疫组织化学染色：,3.2.8. 滴加1：200生物素化二抗，放入孵育湿盒内，室温孵育45 min,标签,3.2免疫组织化学染色：,PBS,3.2.9. PBS冲洗3次，每次5 min。,3.2
40、免疫组织化学染色：,3.2.10.用前30 min ，按一定比例混合A液（亲和素）和B液（酶标生物素）形成亲和素生物素亚饱合复合物（稀释倍数1：1：100），室温孵育40 min。,标签,3.2免疫组织化学染色：,PBS,3.2.11. PBS冲洗3次，每次5 min。其间配制DAB-H2O2显色液（2.5 ml DAB，加1 l H2O2）,3.2免疫组织化学染色：,3.2.12. DAB-H2O2显色，冷蒸馏水冲洗、PBS冲洗，自来水洗净。显色应注意温度与时间的关系，室温宜5分钟。染色稍浅亦可拿出，脱水，封片后颜色可加深。,标签,3.2免疫组织化学染色：,3.2.13. 用苏木精复染,标签
41、,3.2免疫组织化学染色：,3.2.14. 脱水、透明,70%乙醇80%乙醇90%乙醇100%乙醇I100%乙醇II二甲苯I 二甲苯II,每级1min,3.2免疫组织化学染色：,3.2.15. 封片： 加中性树胶封片,3.2免疫组织化学染色：,第一抗体由PBS取代同步进行以上实验。,3.3对照设置：,2.实验材料,成体家鸡,2.1实验动物,2.2主要试剂,2.实验材料,一抗：5-HT抗体 北京中山生物技术有限公司VECTASTAIN ABC 免疫组织化学试剂盒：包括正常血清、试剂A、试剂B和二抗，由美国ZYMED公司生产。,氯化钠、苦味酸、甲醛（36%） 、乙醇、二甲苯、石蜡、硫酸铬钾、明胶、
42、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾 、氯化钾、Tris、30%过氧化氢、3，3-二氨基联苯胺（DAB） 、盐酸、氢氧化钠,苏木精，高锰酸钾，钾矾。,2.3其它试剂,2.实验材料,LEICA组织切片机展片台电热恒温培养箱、冰箱电子天平酸度计移液器LEICA 显微镜,2.4 仪器设备,2.实验材料,2.5试剂配制与用具准备,2.实验材料,改良的Bouin,s固定剂的配制 苦味酸饱和水溶液 75 ml 福尔马林（ 36%甲醛） 25 ml,粘片剂：铬矾明胶液 铬矾（硫酸铬钾） 0.5 g 明胶 5 g 蒸馏水 1000 ml,2.5试剂配制与用具准备,2.实验材料,在1000 ml的烧杯中，加入500-800
43、ml蒸馏水，加明胶溶解后，再加入铬矾，控制水温在70 ，温度过高易使明胶烧糊。如有明显残渣过滤后使用。 4冰箱保存。,2.5试剂配制与用具准备,2.实验材料,NaCl 8.1816g KCl 0.201gNa2HPO412H2O 3.58 gKH2PO4 0.245g1000 ml 双蒸水,用1 mol/L HCl 或 1 mol/L NaOH 调pH 7.4,0.01 mol/L，pH7.4的磷酸缓冲液（PBS）,2.5试剂配制与用具准备,2.实验材料,显色液：DAB（3，3 二氨基联苯胺四盐酸盐）,注意：此液能诱发皮肤癌，在显色反应时应尽量避免接触皮肤。,为0.05% DAB，0.01%
44、H2O2，0.5 mol/L pH 7.6 Tris-HCl 缓冲液显色剂。,DAB显色液配制方法：,1液： 0.5mol/L pH7.6 Tris-HCl 缓冲液100 ml。称6.05 g Tris 溶于50 ml 双蒸馏水中，用1mol/L HCl 调pH 7.6，再加双蒸馏水至100 ml。2液：取1液10 ml 加双蒸馏水90 ml。称取 50 mg DAB 放入棕色细口瓶内。将上液加入搅拌，有时需放在37 温箱内，待全溶解后避光过滤，将滤过液加盖密封保存在4 冰箱备用。3液：用棕色小瓶取2液5 ml，加30% 过氧化氢(H2O2) 原液2 l 搅匀即用。,正常血清，15：1000，
45、 1000 l缓冲液中加正常血清15 l。同样方法配制：第一抗体，1：50-1：120；第二抗体，1：200。ABC试剂，1：1：100。用前30min配制，先取缓冲液100 l注入离心管，再加1 l A，最后加1 l B。DAB显色剂：用棕色瓶取2液5 ml，加2 l 30% 的H2O2 。用前现配。,配制免疫组化试剂：,配制苏木精染液：,Hansen化钾矾-苏木精：,分别溶解，将1液注入2液，再加3液3ml，即时搅拌，加热至煮沸0.5-1min，迅速冷却。,a 取新载玻片放入洗衣粉水中浸泡12-24 h，以自来水冲净，蒸馏水过两遍，放入95%乙醇中备用。b 用干净纱布擦载玻片，选洁净无瑕疵者，涂一薄层铬矾明胶，放入37温箱中烘干后备用。,准备载玻片：,生物技术03（3） 1301 丁一博,理 论 测 验,1.实验设计：用ABC法检测家鸡消化道内5-HT细胞的分布，要求写出详尽合理的实验设计方案（包括详细的时间安排，用品试剂准备情况等）,理论测验,一、包埋 每人包埋一个蜡块二、切片 每人贴五张片子备用三、染色 每人上交一张染好的装片,
