1、登革病毒实验室诊断,登革病毒的概述,黄病毒科黄病毒属 单股正链RNA登革病毒 、 4个血清型形态结构球形，直径37nm50nm 含单股正链RNA，长度约11Kb 编码3种结构蛋白，7种非结构蛋白5-C-PrM(M)-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-33端非编码区含高度保守的核苷酸序列宿主范围3种自然宿主：伊蚊、人、低等灵长动物,登革病毒成熟颗粒模拟图,普通登革热： 登革热(dengue fever)是由登革热病毒所引起，由伊蚊传播的急性传染病。其临床特征为突起发热，头痛，全身肌肉、骨骼和关节痛，极度疲乏，皮疹，淋巴结肿大及白细胞减少，部分病人有出血倾向，病情
2、较轻，通常可自行恢复。 登革出血热： 病情较重，致死率高。通常发生于过去已感染过登革病毒而再次感染其他型别的人，发病的严重程度与病人血清原来存在的登革病毒抗体密切关系。登革休克综合症：,全球形势,DF广泛分布于有媒介伊蚊存在的热带、亚热带地域。在东南亚、西太平洋和加勒比海地区呈现地方性流行。世界卫生组织警告登革热病例正在迅猛增加已威胁到全球三分之一人口的健康安全WHO估计，全球约25亿的人群处于DF的威胁中。全球每年有5000万人感染登革热病毒，其中50万为DHF病例（其中大部份为儿童）。目前全世界还没有有效的疫苗预防登革热。,埃及伊蚊,白纹伊蚊,在东南亚及海南省，埃及伊蚊是本病的主要媒介。在
3、广东、广西，白纹伊蚊是主要媒介。白纹伊蚊孳生于房屋内外的浅水及积水中。成蚊白天吸血，嗜人血。,传 播 媒 介,流行病学,患者和隐性感染者是主要传染源 。在流行期间，隐性感染者的数量可达全体人群的1/3，可能是最重要的传染源。主要发生于市镇人口集中地区，发病与布雷指数有关。雨季为发病高峰季节。广东省510月流行。其中8、9月份为高峰。有一定的周期性（45年）。人与人之间不会直接经过呼吸道、消化道或接触等传播。人群易感性和免疫力 人对登革病毒普遍易感，但感染后并非人人发病。由于对不同型别毒株感染无交叉免疫力，因此可以发生二次感染。感染一种病毒型产生的免疫对同型病毒免疫力可持续14年，而对异型病毒的
4、免疫则短。,登革热流行与预防,有利于DF流行的因素登革病毒（带毒蚊、人、兽）输入输入地自然气候输入地伊蚊密度、 屋内处积水容器、 居民养花、养莲、 建筑工地积水、水缸积水预防登革热健康提醒：1.到登革热流行区旅游或生活，应穿着长袖衣服及长裤，并在外露的皮肤及衣服上涂蚊虫驱避药物；2.如果房间没有空调设备，应装置蚊帐或防蚊网；3.使用家用杀虫剂杀灭成蚊，并遵照包装指示使用适当的分量；4.避免在“花斑蚊”出没频繁时段在树荫、草丛、凉亭等户外阴暗处逗留；5.防止积水，清除伊蚊孳生地；6.尽量避免用清水养植植物；7.对于花瓶等容器，每星期至少清洗、换水一次，勿让花盆底盘留有积水。把所有用过的罐子及瓶子
5、放进有盖的垃圾桶内。,实验室确诊病例,普通登革热：登革病毒血清特异性IgM抗体阳性，结合临床症状恢复期血清特异性IgG抗体比急性期有4倍以上增长从急性病人血清、脑脊液或尸解脏器中分离到病毒或检测到病毒序列或检测到病毒抗原登革出血热：多器官大量出血肝肿大血容比增加20以上登革休克综合症：伴休克,登革热实验室检测常规方法,C6/36细胞培养技术登革病毒的分离和鉴定血凝抑制试验（HI）补体结合试验（CF）中和试验（NT）间接免疫荧光试验（IFA）酶联免疫吸附试验（ELISA）胶体金免疫层析快速诊断试验 免疫斑点试验 (DIBA )RT-PCR荧光PCR,标本的采集与保存,采集对象 主要为登革热疑似病
6、例、临床诊断病例等，必要时采集疑似病例的密切接触者标本。根据采样时间确定检测目的病原学检测 初次感染： 出现登革热症状的前12和发病后的35天 再次感染： 出现登革热症状的前后12天血清学检测初次感染：出现登革热症状1周后可检测到IgM;2周后可检测到IgG 再次感染：出现登革热症状后12天可检测到IgM和IgG,标本的采集与保存,蚊媒标本主要为埃及伊蚊、白纹伊蚊或其它可疑蚊种，检测抗原，常用于登革病毒监测。采集回来的蚊子置20冻死后，按蚊种及捕获地点分组，以每组2050只分装于螺口冻存管，70C冰箱或液氮保存。蚊媒标本的检测目的是登革病毒分离或登革病毒核酸检测，因此标本采集后应确保存于超低温
7、条件下。,蚊虫标本研磨程序,一组标本（50只蚊子）转入1.5ml 的eppendorf离心管加入100l标本处理液用小型电动研磨器将蚊子磨匀补加900l标本处理液4C，10000rpm，离心10min,标本处理液:MEM 90ml 小牛血清 2 ml 庆大霉素（50g/ml)100l两性霉素B（1000g/ml）1ml青链霉素（1000U/ml） 1ml用7.5%碳酸氢钠溶液调至PH7.2。 用于： 登革病毒分离 登革病毒核酸检测剩余的研磨液需保存在-70C冰箱中以备复查。,注意：研磨过程最好在冰上操作； 低温离心机4,标本的采集与保存,血液标本是登革病毒检测的主要标本，采集5ml为宜，血清、
8、血浆都可，可检测抗原或抗体。用于抗体检测的血清标本最多可在28保存一周，长期保存应在20以下。用于抗原检测的血清标本应保存于70 。全血冰冻溶解后会产生溶血，未分离血清的标本应避免冰冻保存。,感染登革病毒后的免疫反应,采集第二份血的重要性,17天，7080核酸阳性，晚恢复期血清（1430天）抗体检测可进一步确认可分辨初次和二次感染对于初次感染，晚恢复期血清可用以型别鉴定,检测方法的选择,5天 急性期，3种方法813天 早恢复期 1430天 晚恢复期病毒分离 7天 抗体检测 3小时病毒核酸检验 2-3小时,血清抗体检测,登革病毒的分离和鉴定,所用样本急性期血清、血浆、淋巴细胞尸体组织：尤其是肝、
9、脾、淋巴结、胸腺蚊子样本的保存48小时内进行病毒分离，可放于48存放时间较长，应把血清分离出来，70 保存，避免冻融淋巴细胞，抗凝血应在几小时内送实验室分离方法：敏感细胞分离、乳鼠接种分离、蚊虫接种分离。常用C6/36细胞进行登革病毒分离。鉴定方法：中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验、单克隆抗体免疫荧光技术、PCR技术。,病毒分离,1.接种到蚊头(最敏感)2.接种敏感细胞：C6/36，BHK21（成本效益最高）3.接种乳鼠鉴定方法：中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验、单克隆抗体免疫荧光技术、PCR技术。,C6/36细胞分离登革病毒,单层C6/36细胞的准备（ C6/36细胞通常28培养23
10、天后可长成单层，710天传下一代。 C6/36细胞形态为类圆形，易于贴壁生长，但贴壁不牢。 C6/36细胞是传代细胞，理论上可以无限传代。）细胞管法、细胞板法标本的处理血清标本、蚊虫标本和组织标本 标本接种接种、吸附、细胞毒性的处理结果观察每天观察细胞生长情况,正常C6/36细胞（100X）,C6/36细胞接种病人血清第二天时出现的血清毒性现象（100X）,细胞培养分离登革病毒,登革1型病毒在C6/36细胞上病变情况（100X）,登革2型病毒在C6/36细胞上病变情况（100X）,登革3型病毒在C6/36细胞上病变情况（100X）,登革4型病毒在C6/36细胞上病变情况（100X）,血凝抑制试
11、验,血凝试验,血凝抑制试验,有血凝素（HA）的病毒能凝集人或动物红细胞，称为血凝现象，血凝现象能被相应抗体抑制称为血凝抑制试验，原理是相应抗体与病毒结合后，阻止病毒表面HA与红细胞结合，使原有的血凝反应被抑制。过去最常规的方法，优点：敏感容易操作，需要的仪器少，结果可靠，HI抗体可存在3045年；缺点：样本要预处理，必须双份血，难以区分登革病毒感染和其他黄病毒感染（如乙脑病毒、西尼罗病毒等） 。,补体结合试验,抗体与抗原反应形成复合物，通过激活补体而介导溶血反应，可作为反应强度的指示系统。没有广泛应用，操作较难，可用于检测现感染，不适用于血清流行病学研究。,中和试验（NT）,优点：最特异和敏感
12、的方法缺点：昂贵，耗时长，技术复杂，不常用,间接免疫荧光试验,抗原,抗体,荧光标记抗抗体,原理：,缺点：需要荧光显微镜，和富有经验的试验人员,快速检测试剂,全血、血清、血浆含所有检测所需物品储存温度 (2 - 30C) 90% 敏感性和特异性15 分钟出结果可鉴别初次和二次感染25 tests,酶联免疫吸附试验,酶标记登革病毒单抗与登革病毒复合物,人IgM抗体,抗人IgM单克隆抗体,捕捉法（检测登革病毒抗体IgM）,IgM抗体出现的比IgG早一点,约5天后可以查到。初次感染的IgM比二次感染高的多，IgM可持续23个月诊断意义：IgM阳性不表明现感染，有可能是23个月前感染，在登革尚未地方性流
13、行地区，可用于临床检测和人群监测,酶联免疫吸附试验间接法(检测登革病毒抗体IgM或IgG),1. 酶标板孔上包被登革病毒抗原,2. 每孔中加血清标本稀释液 （如果含登革病毒抗体IgM或IgG即可结合）,3. 加HRP标记的二抗（抗人IgM或抗人IgG），在适当的底物作用下呈现颜色反应,4. 肉眼判断颜色深浅或加终止液后用酶标仪读取每孔不同的吸光值，初步判断标 本中抗体的含量,IgG 非特异，与其它黄病毒有交叉反应，不能用于分型，敏感性比HI好，正取代HI,登革病毒的核酸检测：PCR检测与鉴定登革病毒处理流程,血清（细胞上清或组织研磨液）,病毒RNA提取,cDNA的合成,登革病毒型特异引物PCR
14、扩增,凝胶电泳，结果判断,用QIAamp Viral RNA Kit或者Roche Viral RNA Kit提取病毒RNA,根据PCR特异性产物片段大小进行判断,RT-PCR检测登革病毒基因与分型登革热诊断标准（WS216-2008）,500bp,500bp,通用引物PCR结果,分型引物PCR结果,M I ,M I ,通用产物：511bp 分型产物： ：482bp， ：119bp， ：290bp， ：392bp,Real time PCR检测登革病毒处理流程,血清（细胞上清或组织研磨液）,病毒RNA提取,cDNA的合成,Real timePCR,结果判断,用QIAamp Viral RNA
15、Kit或Roche Viral RNA Kit提取病毒RNA,登革病毒是RNA病毒，PCR前先进行RT,根据Real time PCR后软件分析得到的扩增曲线进行判断,引物与探针的特异性是反应成功与否的关键因素,登革病毒检测用引物与探针登革热诊断标准（WS216-2008）,登革病毒通用引物 Den-FP： 5 GCATATTGACGCTGGGAGAGA3Den-RP： 5GGCGTTCTGTGCCTGGAAT3登革病毒通用探针Den-Probe：5 FAMCAGAGATCCTGCTGTCTCMGB3 引物和探针均由上海基康生物技术有限公司合成及标记，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。也可用商业化试
16、剂盒（上海之江生产的登革热通用性荧光PCR核酸检测试剂盒）。也可用荧光PCR方法对登革病毒进行基因分型（WS216-2008）。,登革病毒基因组序列测定与分析,DNA序列测定是分析某特定基因的结构和功能的基础。登革病毒基因组的序列分析可反映登革病毒基因变异的遗传信息。通过测定来源于不同时期不同地理区域不同动物宿主登革病毒株的核苷酸序列，可对登革病毒的分子进化史进行系统分析。,E基因：中和抗原表位，型特异表位，在登革病毒的致病和免疫中起着至关重要的作用,历年深圳市登革热病例病毒型别,2005年：D2，D42007年：D32008年：D1，D22009年：D2，D32010年：D1（首次本地爆发疫
17、情）深圳市历年发生的登革热疫情，病毒流行株的E基因序列均可追溯到国外的毒株，提示深圳市的登革热仍有可能为输入性的，输入地主要为东南亚各国。,深圳市登革病毒E基因进化分析,登革2型病毒分离株SZ0521的系统进化树,登革4型病毒分离株SZ0524的系统进化树,疑似登革热病人发病内血清,接种C6/36细胞,IgM、IgG ELISA,Real time RT-PCR快速测登革病毒（可选）,IgM和IgG ELISA阴性,IgM或IgG ELISA阳性,Real time RT-PCR或RT-PCR鉴定,阴性盲传3代仍为阴性,判定登革病毒型别,登革病毒培养阴性,判定为阴性,IgG阳性，IgM很低或阴性,IgM很高，IgG很低或阴性,IgM和IgG阳性，但较低,二次感染,初次感染,IgM和IgG仍保持较低水平甚至降低,IgM升高或IgG4倍升高,采集第二份血,判为阴性,判为阳性,建 议,1.尽可能采集早期样本，标明病人的发热时间，采样时间，关系到检测方法的选择2.血清学检测同时检测IgM和IgG抗体，以免漏检3. 采集双份血4.留意其它虫媒病毒病（例如基孔肯雅热）,Thank You !,
