1、,Enterovirus type 71 inactivated vaccine,课程：生物技术制药,班级：2013生技一班,肠道病毒71型灭活疫苗,刘雨桐,EV71图片,肠道病毒 71 型( enterovirus 71， EV71) 为单股正链 NA病毒，是小 NA 病 毒 科 肠 道 病 毒 属 中 的 重 要 成 员 之 一。EV71 基因组由 7400 多个核苷酸构成， 包含一个开放读码框，编码大约 2200 个氨基酸的多聚蛋白。该多聚蛋白可被进一步水解成 P1、 P2 和 P3 三个前体蛋白，P1 前体蛋白编码VP1、 VP2、 VP3 和 VP4 四种结构蛋白，P2、 P3 前体
2、蛋白编码 7种非结构蛋白( 2A 2C 和 3A 3D) EV71 包括 A、 B 和C 3 种基因型，11 个基因亚型， 每种亚型感染均可引起手足口病( hand， foot and mouth disease， HFMD,EV71简介,01,02,02,03,人血浆中含有的中和抗体可在细胞基质上中和不同的 EV71。可减少或消除毒株攻击乳鼠后的致病及死亡现象，而在毒株攻击乳鼠的同时或其后限定的时间内注射含 EV71 中和抗体的人血浆，可起到保护乳鼠的作用,EV71 感染或疫苗免疫动物后产生的抗体具有病毒中和活性；中和抗体在体外与 EV71 中和后，可减少或消除毒株攻击乳鼠后的致病性；,EV
3、71 疫苗除能诱导中和抗体外，还能诱导细胞免疫应答，其也具有免疫保护作用。,EV71疫苗可行性,01,02,03,04,全病毒灭活疫苗,减毒活疫苗,基因工程疫苗,病毒样颗粒( VLPs)疫苗,肠道病毒 71 型疫苗分类,05,合成肽疫苗,为什么选择灭活疫苗,生产工艺成熟， 具有良好的免疫原性及安全性， 众多研究证明灭活 EV71 病毒疫苗较其他形式疫苗， 如 VP1 亚单位疫苗、 DNA 疫苗、 VLP 疫苗有更好的免疫效果， 是 EV71 疫苗发展的主要类型。目前进入临床研究的 5 株 EV71 疫苗均为灭活疫苗， 而临床试验结果表明这些疫苗均有较好的免疫原性及安全性。（2014）,在中国内
4、地1998 年后流 行株均为 C4， 故中国企业研发的疫苗均以 C4 型毒株作为疫苗株。,1,2,二倍体细胞疫苗生产工艺：疫苗株 株在人二倍体细胞 （株）上适应传代，收获病毒液，经灭活、浓缩、层析过滤，吸附氢氧化铝佐剂后，制备成为肠道病毒 型灭活疫苗成品。,细胞疫苗生产工艺：疫苗株株或株感染 细胞后，收获病毒培养液，经超滤浓缩、凝胶过滤、离子交换层析纯化、甲醛灭活，吸附氢氧化铝佐剂后，制备 7灭活疫苗成品。,灭活疫苗两种类型,01,病 毒 液 的培养 及 灭 活,02,EV71病毒的纯化、检测及制备,03,灭活疫苗免疫原性检测及保护性研究,灭活疫苗制备一般流程,1,2,病毒液的灭活收获病毒液按
5、 （）加入福尔马林， 灭活，并每间隔2取样，采用微量滴定法进行感染性滴度检测以观察其灭活效果。,病毒微量滴定法：将灭活后的病毒液按 倍梯度稀释，以 孔置于孔平底细胞培养板，每个稀释度接种孔， 每孔按 细胞培养液加入细胞，、时观察记录病变，超过细胞病变孔判为病变阳性,病 毒 液 的 灭 活,EV71病毒的纯化、检测及制备, 分 析,分 析, 检测,将纯化后的产品进行灭活疫苗成品的制备,01,02,03,04,01,02,03,04,膜分离技术,超速离心,凝胶过滤层析（ gel filtration chromatography，GF ）,离子交换层析（ ion-exchange chromato
6、graphy，IEC ）,肠道病毒 71 型灭活疫苗分离纯化方法,05,疏水相互作用层析（ hydrophobic interaction chromatography，HIC）,03,Options,01,Options,疫苗标准方面国家质量控制和审评部门结合2010版 中华人民共和国药典 和修订企业注册标准中对预防性疫苗的要求，对申报临床试验的灭活疫 苗 毒 株、原 液 和 成 品 标 准 进 行 规 范 和 统一。对种子库要求 疫 苗 主 要 保 护 区 氨 基 酸 序列在三级种子批均保持一致；,疫苗纯度控制方面在疫苗纯度控制上，高效液相色谱法 （）规定颗粒峰面积不低于，疫苗动物效力统一
7、修定为以针后半数有效量 （）作 为 效 力 指 标， 保证了疫苗生产的一致性和有效性；,标准品方面中国食品药品检定研究院 （中检院）联合家企业已完成了疫苗中和抗体检测标准品和疫苗抗原定量标 准品的研制（国生标字、） 。正在开展的疫苗标准研究 包括：比 活 一 致 性 标 准，细 胞 残 余N标准等；开展的疫苗标准品研究 包括疫苗效力标准品和冻干标准中和抗体检测株等,目前， 亚洲地区进入临床试验阶段的灭活疫苗有 5 家( 其中 3 家来自中国大陆，另外 2 家分别来自我国台湾和新加坡) ，他们采用的病毒株、细胞系、 培养技术和免疫佐剂有所不同( 表 1),北京微谷生物医药有限公司( Vigoo)
8、 、 中国科兴生物制品有限公司( Inovac) 和中国医学科学院( CAMS) 所研制的疫苗在 2013 年已完成了临床期试验， 而我国台湾国家卫生研究院( NHI) 和新加坡Inviragen公司研制的疫苗正在进行临床期试验( 表 2) 。,Vigoo 以 160、 320和 640 U 剂量加以氢氧化铝佐剂的福尔马林灭活疫苗随机接种包括 12 36 月龄儿童和 6 11 月龄婴儿在内的 12 000名受试者。结果显示，疫苗仍然具有较好的疫苗效能， 可使约 90% 的受试者能抵御 HFMD，80% 的抵御疱疹性咽峡炎或相关神经症状。,Sinovac 分别以 400 U 加以氢氧化铝佐剂的疫
9、苗或安慰剂随机接种 10 077 名受试者， 其疫苗效能可达 88% 以上。,CAMS 则对 12 000 名 6 71 月龄的婴儿和儿童随机接种了 100 U 疫苗或安慰剂，疫苗也显示出了良好的安全性和免疫原性，但具体信息不详,NHI 研制的疫苗不仅对EV71B1、 B5 和 C4A 亚型具有较强的中和活性，对柯萨奇病毒 A16 也有一定的交叉中和活性,在期试验中,中国医学科学院医学生物学研究所全球首个针对肠道病毒71型（EV71）感染所致手足口病的创新疫苗,通用名称：肠道病毒71型灭活疫苗（人二倍体细胞）,英文名称：Enterovirus Type 71 Vaccine ,Inactiva
10、ted（Human Diploid Cell）,（1）疫苗毒种是我国流行株，具有良好的免疫原性和抗原交叉反应性。（2）细胞基质采用人胚肺二倍体细胞，有效保证在儿童群体中使用的安全性。（3）生产技术采用细胞工厂大规模培养技术，有效提高疫苗产能和质量。（4）建立的疫苗保护性评价婴猴动物模型，为开展疫苗保护性效果的系统分析和评价创造基础条件。（5）对不同基因型毒株的交叉保护试验，进一步证明该疫苗对多数基因型别的EV71感染均具有保护效果。,（6）疫苗诱导免疫反应的相关研究，为进一步阐明EV71感染致病机制及疫苗免疫学机理提供了大量数据和资料。是目前国内外新型疫苗研发中的重要创新点。,北京科兴生物制品
11、有限公司自主研发的预防用生物制品1类新药益尔来福获批,通用名称：肠道病毒71型灭活疫苗（Vero细胞）,英文名称：Enterovirus Type 71 Vaccine ,Inactivated （Vero Cell）,全球首创预防用生物制品1类新药 对EV71所致手足口病的保护率高达94.6% 对EV71所致手足口病重症和住院病例保护率为100% 稳定性良好，有效期长达3年 不添加防腐剂与稳定剂，进一步降低安全风险 全球最高标准控制Vero细胞宿主蛋白与DNA残留,灭活疫苗仍然存在问题,1,2,3,EV71 免疫保护机制复杂，除体液免疫外， 细胞免疫也发挥着重要的作用。然而，灭活疫苗主要诱导
12、的是体液免疫， 细胞免疫不够充分。,灭活疫苗生产和运输成本高昂。疫苗效力较高而疫苗价格较低的常规免疫才符合我国的成本效益 ， 这可能会制约灭活疫苗的应用。,EV71 本身存在抗体依赖性增强感染现象，不恰当的疫苗接种有可能会增加重症病例的风险。,参考文献,1.梁燕, 赵红玲, 刘龙丁, 廖芸, 董承红, 纳锐雄, et al. 肠道病毒71型灭活疫苗的规模化制备和免疫原性研究J. 中国病毒病杂志. 2012(06).2.梁争论. 我国肠道病毒71型灭活疫苗研发现状J. 中国病毒病杂志. 2012(06).3.马洁, 邓永强, 秦成峰, 秦鄂德. 肠道病毒71型疫苗研究进展J. 军事医学. 2015(07).4.王一平, 姚昕, 毛群颖, 梁争论. 肠道病毒71型疫苗质量控制研究进展J. 微生物学免疫学进展. 2015(05).5.肖慧, 明平刚, 陈晓琦, 徐葛林. 肠道病毒71型灭活疫苗分离纯化方法的研究进展J. 中国生物制品学杂志. 2015(10).,大,谢,谢,家,！,
