1、常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍 (2011-04-23 11:01:29)转载标签： 分子生物学 细胞生物学 常用实用技术 基本实验室技术 生物学实验 教育常用的分子生物学基本技术核酸分子杂交技术由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组 DNA 和细
2、胞总 RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知 DNA 或 RNA 片段。根据其来源和性质可分为 cDNA 探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA 探针等。固相杂交固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的 DNA 固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。斑步杂交（dot hybridization）是道先将被测的 DNA 或 RNA 变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的 DNA 或RNA 探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电
3、永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。印迹杂交（blotting hybridization）Southern 印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的 DNA 片段，将凝胶上的 DNA 变性并在原位将单链 DNA 片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色，检测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析
4、（RELP）等。Northern 印迹杂交 :由 Southerm 印杂交法演变而来，其被测样品是 RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离后，转移到固相支持物上，进行杂交反应，以鉴定基中特定mRNA 分子的量与大小。该法是研究基因表达常用的方法，可推臬出癌基因的表达程度。差异杂交（differential hybridization）是将基因组文库的重组噬菌体 DNA 转移至硝酸纤维素膜上，用两种混合的不同 cDNA探针（如：转移性和非转移性癌组织的 mRNA 逆转录后的 cDNA）分别与滤膜上的DNA 杂交，分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的基因。适用于基因组不太复杂的真核生物（
5、如酵母）表达基因的比较，假阳性率较低。但对基因组非常复杂的盐酸核生物（如人），则因工作量太大，表达的序列所占百分比较低（仅 5左右），价值不大。cDNA 微点隈杂交（cDNA microarray hybridization）是指将 cDNA 克隆或 cDNA 的 PCR 产物以高度的列阵形式排布并结合于固相支持物上（如：尼龙膜或活化的载玻片）以微点阵，然后用混合的不同 DNA 探针与微点阵上的DNA 进行杂交。再利用荧光、化学发光、共聚焦显微镜等技术扫描微点阵上的杂交信息。它比差异杂交技术的效率高、速度快、成本低，适用于大规模的分析。已成商品问世。其缺点是无法克服保守的同源序列及重序对杂交信
6、息的干扰。寡核苷酸微点隈杂交（oligonucleotide microarray hybridization）是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸，使它共价结合于支持物表面，与平均长度为 20-50nt 的混合 RNA 或 cDNA 探针进行杂交，以提高杂交的特异性和灵敏度。应用共聚焦显微镜可检测跨越三个数量级的杂交信息。适用于低丰度 mRNA 的检测，以区分基因家族不同成员的差异表达特征，或鉴定同一转录在不同组织和细胞中的选择性剪接。但有工作量较大、成本较高、速度较慢等弱点。液相杂交（solution hbridization）指使变性的待测核酸单链与放射笥核素标记的已知的酸单链（探针）
7、在溶液中保温，使之形成杂交复合物。反应结束后，用羟磷灰石法或酶解法将未被杂交的单链和杂交双链分开，然后结膈后在杂妆分子中的探针量，就可推算出被测的核酸量。递减杂交（subtractive hybridizatio）是利用两种来源一致而功能不同的组织细胞提取 mRNA（或逆转录成的 cDNA）, 在一定的条件下以过量的驱动 mRNA 或 cDNA 与测试的单链 cDNA 或 mRNA 进行液相杂交，通过羟基磷灰石柱层析筛选除去两者间同源的杂交体。经多轮杂交策选、除去两者之间相同的基因成分，保留特异表达的目的基因或工基因片段。以后者筛选 cDNA 文库，可获得特异表达的目的基因 cDNA 全长序列
8、。核酸原位杂交用特定标记的已知顺序核酸作为探针与细胞级或组织切片中核酸进行复性杂交并对其实行检测的方法，称为核酸原位杂交（nucleic acid hybridization in situ）。用来检测DNA 在细胞核或染色休上的分布，与细胞内 RNA 进行杂交以研究该组织细胞中特定基因表达水闰；还用于细胞、组织中有无特异性菌、病毒检测的研究。该法的优点是特异性高，可精确定位；能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响；不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性；并可完整地保持组织与细胞的形态。因此被广泛应用于医学生物学的研究，如基因定位、基因制
9、失，基因易位、特异基因整合部物色检测等研究。近年来由定性发展到定量，方法更为完善。DNA 分子克隆技术（也称基因克隆技术）在体外将 DNA 分子片段与载体 DNA 片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中 DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步骤包括：制备目的基因将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成 DNA 重组导入宿主细胞筛选、鉴定扩增和表达。载体（vecors ）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA 分子片段。主要目的是获得某一基因或 NDA 片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的 DNA 片
10、段不同，有两种 DNA 库，一种是基因组文库（ genomic library）,另一种是 cDNA 库。载体 所谓载体是指携带靶 DNA 片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。细菌质粒 是一种细菌染色体外小型双链环状结构的 DNA，分子大小为 1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。最常用的质粒是 pBR322。噬菌体（phaeg） 噬菌体是感染细菌的病毒，按其生活周期分为溶菌型及溶原型两型。用野生型 噬菌体改造和构建的噬菌体载体是线性双链 DNA，基因组约为 50kb，最常用的哓菌体为 DNA 及其衍生系列。黏性质粒（co
11、smid） 是由质粒与噬菌体 DNA 组成的一种 4-6kb 的环状杂种 DNA。表达型载体 将上述细菌质粒载体或噬菌体载体接上启动基因及多聚核糖体的基因序列组成了表达型载体。基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组 DNA 克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进 一步的研。其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA 片段的制备；（3）DNA 片段与载体 DNA 的连接；（4）包装和接种。cDNA 库的建造是指克隆的 DNA 片段，是由逆转录酶自 mRNA 制备的 cDNA。c
12、DNA 库包括某特定细胞的全部 cDNA 克隆的文库，不含内含子。特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2 ）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。核酸序列测定DNA 的碱基序列决定着基因的特性，DNA 序列分析 （测序，sequencing ）是分子生物学重要的基本技术。无论从基因库中筛选的癌基因或经 PCR 法扩增的基因，最终均需进行核酸序列分析，可藉以了解基因的精细结构，获得其限制性内切酶图谱，分析基因的突变及对功能的影响，帮助人工俣成基因、设计引物，以及研究肿瘤的分子发病机制等
13、。测序是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的。目前最常用的方法有 Maxam-Gilbert 的化学降解少和 Sanger 的双脱氧法等，近年来已有DNA 序列自动测定仪问世。化学降解法是在 DNA 的片段的 5端标记核素，然后用专一性化学试剂将 DNA 特异地降解，在电泳和自显影后，可得到从标记端延伸的片段供测读序列和进行比较。一般能读出 200-250 个核苷酸序列。双脱氧法是采用核苷酸链终止剂，如：2，3- 双脱氧核苷三磷酸 ddNTP(如 ddTTP、ddTTP、ddGTP 和 ddCTP中的一种)掺入到 DNA 链中以终止链的延长，与掺入 4 种正常的 dNTP 的
14、混合物分成四组进行反应，这样可得到一组结尾长衙不一、不同专一性核苷酸链终止剂结尾的 DNA片段，经凝胶电泳分离和放射自显影，可读出合成的 DNA 核苷酸序列，根据碱基互补原则，可推算出模板 DNA 分子的序列。化学降解法只需一化学试剂，重复性好，容易掌握；而双脱氧法需单链模板、特异的寡核苷酸引物及高质量的 DNA 聚合酶，便随着 M13 噬菌体载体的发明和运用，合成的引物容易获得，测序技术不断改进，故此法已被广泛应用。基脱氧法的自动激光荧光测序仪，使测工作更快速和简便，而且保证高度重复性。至于 RNA 测序现大多采用将 mRNA 逆转录成 cDNA 后同测序，然后反推 RNA 序列聚合酶链反应
15、技术聚合酶链反应技术简称 PCR 技术，是一种利用 DNA 变性和复性原理在体外进行特定的DNA 片断高效扩增的技术，可检出微量靶序列（甚至少到 1 个拷贝）。在模板 DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于 DNA 聚合酶的酶促合成反应。仅需用极少量模板，在一对引物介导下，在数小时 内可扩增至 100 万-200 万份拷贝。PCR 反应分三步：变性、退火及延伸。以上三步为一循环，每一循环的产物作为下一个的模板，这样经过九小时的循环，每一循环的产物作为下一个循环的模板，这样经过数上时的循环后，可得到大量复制的特异性 DNA 片段。反应条件一般为 94变性 30 秒，55退火 30 秒
16、， 70-72延伸 30-60 秒，共进行 30 次循环左右，最后再延伸 725分钟，4冷却终止反应。1.逆转录 PCR(RT-PCR)用来扩增 RNA 的方法。2.竞争逆转录 PCR(competitive reverse transcription-polymerase chain rection C-RT-PCR)低丰度 RNA 定量的好方法。3.多重 PCR（multiples PCR）在同一 PCR 体系中加入多对引物可用于基天长度很长，发生多处缺失的觳狻鐾 荒宓募父銮 颉?br4.多种 PCR 可同时加入多套以生物素标记的引物起进手 PCR 反应。5.反向 PCR（iverse p
17、olymerase chain reaction）对一个已知的 DNA 片段两侧的未知序列进行扩增和研究。6.不对称 PCR 在扩增循环中引入不同引物浓度，以得到单链 DNA 并进行列测定，以了解目的基因的序列。7.锚定 PCR（anchored polymerase chain reaction）帮助克服序列未知或序列未全知带来的障碍。在未知序列未端添加同聚物尾序，将互补的引物连接于一段带限制性内切酶位点的锚上，在锚引物和基因另一侧特异性引物的作用下，将未知序列扩增出来。8.着色互补试验或荧光 PCR（color complementation assay or fluorescent PC
18、R）原理是用不同荧光染粒，分别标记于不同寡核苷酸引物上，同时扩增多个 DNA 片段，反应完毕后，利用分子筛选去多余的引物。用紫外线照射扩增产物，就能显示某一 DNA 区带荧光染料颜色的组合，如果某一 DNA 区带荧光染色料颜色的组合，如果某一 DNA区带缺失，则会缺乏相应的颜色。9.双温 PCR（two-temperature PCR）仅仅执行两步温度程序。合并退火与延伸温度。一般常用温度是 94-95和 46-47。可以提高反应的速度和特异性。上述这些 PCR 技术的应用：（ 1）PCR 技术扩增特定序列为基础，采用多种方法进行检测，如 PCR-RFLP、PCR-SSCP 从已克隆的双链 D
19、NA 中产生特异性序列作为分子探针；（2 ）通过选择性扩增 cDNA 中产生特异性序列作为分子探针；（2）通过选择性扩增cDNA 中的特殊片段，产生针对尚未克隆的基因的探针；（3）从微量 mRNA 中产生cDNA 文库；（4）产生大量用于序列分析的 DNA；（5 ）分析 基因突变；（6）做染色体步移。10.原位 PCR 技术： PCR 虽然能扩增包括福尔马林固定、石蜡包埋组织的各种标本的DNA，但扩增的 DNA 或 RNA 产物不能在组织细胞中定位，因而不能直接与特定的组织细胞特征相联系，这是该技术一个局限性。原位杂交虽具有良好的定位能力，但由于其敏感性问题，尤其是在石蜡切片中，尚不能检测出低
20、含量的 DNA 或 RNA 序列。而原位 PCR（In situ PCR,简称 IS PCR），它可使扩增的特定 DNA 片段在分离细胞和组织切片中定位，从而弥补了 PCR 和原位杂交的不足，具有良好的应用前景。目前，已有多种设计的原位 PCR 扩增仪系统问世，使操作简便，软件灵活，已成为拉增固定细胞和石蜡包埋组织中特定 DNA 和 RNA 序列的有用工具。IS PCR 的技术特点（1 ）既具有 PCR 的特异性与高灵敏性，又具有原位杂交的定位准确性；（2 ）测到低于 2 个拷贝量的细胞内特定 DNA 序列，甚至可检测出单一细胞中的仅含一个拷贝的原病毒 DNA；（ 3）有助于细胞内特定核酸序列
21、定位与其形态学变化的结合分析；（4 ）可用于正常或恶性细胞，感染或非感染细胞的鉴定与区别。IS PCR 的基本方法IS-PCR 是 PCR 和原位杂交两种技术的绫事，实质是一种将靶 DNA 或 RNA 在原位扩增后再进行原位杂交的技术，操作程序基本兼有两种技术的所有过程，首先在适当处理的细胞和组织切片上滴加 PCR 反应液，然后把载玻片放入热循环仪中进行扩增，最后通过标记的探针进行原位杂交检测扩增产物。初步应用有关原位 PCR 技术应用成功的第一篇报道是对感染绵羊中枢神经系统 visna 病毒在绵羊脉络从一细胞中检查，通过 PCR 扩增，仅用 150 碱基对的短探针就可通过 ISH 检查到了细
22、胞内的 visna 病毒。从开始在试管内细胞行 PCR 扩增后再涂片做 ISH(原位杂交)检查，已发展到用福尔马林固定、石蜡切片的常规病理组织方法做原位 PCR 检查。有传统的标记探针的原位 PCR 法（间接法），也有将标记物先标记 PCR 的引物，让标记物扩增后再行 ISH 检查的直接法。因此，目前就原位 PCR 方法而言，尚未能获得统一，也即未能比较出哪一种方法最可靠简便，各家报道的原位 PCR 技术中，在标本处理和种类上尚不同（细胞悬液、涂片、组织切片等），想检测的靶核酸也不同（病毒或体细胞的 DNA 或 mRNA），扩增的方法上有不同（单引物、多引物），最后显示的方法也不同（直接法、间
23、接法）。这些还都有待在今后的工作中积累经验，以求一致。原位 PCR 应用的课题，目前正片于开始阶段，还很局限，对人体 B 细胞淋巴瘤中 Ig单拷贝基因重组的检查以及对人体外周血中单核细胞 HLA-DQ 不同亚型的测定，归纳起来，主要应用于两方面；（1）检测外源怀基因片段，集中在病毒感染的检查上，如HIV、HPV、HBV、CMV 等；（2 ）内源性基因片段，如人体的单基因病、重组基因、易位的染色体、Ig 的 mRNA 片段、癌基因片段等。基因转染技术将特定的遗传信息传递到真核细胞中，这种能力不但革新了生物学和医学中许多基本问题的研究，也推动了诊断和治疗方面的分子技术发展，并使基因治疗成为可能。目
24、前基因转移技术已广泛用于基因的结构和功能分析、基因表达与调控、基因治疗与转基因动物等研究。本部分将介绍目前基因转移的主要方法；重点介绍基因转移的病毒方法的基因转染（transfection）技术。基因运载系统将某一特定的靶基因传递到靶细胞，需要应用某一基因运载系统，目前将这一系统概括为两大类：非病毒辣方法和病毒方法。1.基因转移的非病毒方法直接注射法 将含有 DNA 的溶液直接注射到肌肉，以引起邻近的细胞摄入 DNA 燕进行表达，在肌细胞中，基因表达可持续数月。磷酸钙共沉淀法 将氯化钙、DNA 和磷酸盐缓冲液混合，形成磷酸钙微沉淀 ，附着于细胞膜并经过细胞内吞作用耐是入细胞质。该方法的转化效率
25、通常很低。脂质体染法 指质体能在体内或体外提供运载外源性遗传物质进入细胞的载体。脂质体介导的基因转移的最大优势在于能在活体内应用。受体介导的基因转移 依靠受体介导的细胞内吞途径以转移外源基因。受体介导的基因转移方法是在质粒 DNA 和某种特异的多肽（配体）之间形成复合体，而这种多肽能为细胞表面的肥体所识别。如若将 DNA 在体内运送至肝内，可以选将 DNA 和能与肝细胞受体特异结合的去唾液酸糖蛋白质偶联，以便通过细胞内吞过程而被摄入，这种DNA 大部分被肝脏所摄取。应用该方法转移的外源基因在活体内的表达持续时间较短，在评估实际应用前影上还在一些问题。显微注射法 在显微镜下，将 DNA 经同细胞
26、玻璃针地接注入细胞，该法适合于各种培养生长的细胞，但需要一定的设备和操作用支巧。电穿孔法 利用脉冲场将 DNA 导入培养细胞。微粒子轰击法（基因枪）近几年发展较快的转移方法。使用高能微粒子轰击将 DNA 导入培胞或活的哺乳动物组织内。亚微粒的钨和金能自发地吸附 DNA，将这些微弹加强速到很的速度轰击细胞。实验结果表明，用这种方法靶基因可在皮肤、肌肉、肝、胰、胃和乳腺等细胞中表达。胚胎干细胞法 胚胎干细胞是从受精卵开始分裂至 4 个国胞阶段未分化和具有多种潜能的生殖细胞，能在体外培养，可作为正面细胞，制备转基因动物，以研究基因定向整合或基因剔险及基因及能。精子载体法 最近发现用精子和 NDA-剂
27、孵育，可捕获得 DNA。通过受精过程，将外源性基因导入受精卵，可捕获得物物，大大间化了转基因动物的制备过程。2.基因转移的病毒的方法病毒作为基因转移的是基因递送有有并工具，病毒载体的优点有：（1）在转化的细胞中传播重组的 DNA 分子作为稳定的遗传成分；（ 2）在可能将有有制陷的或突变的基因置于病毒调节信号的控制下以进行研究；（3）能将克隆的基因作为病毒微染色体的一部分 ，并能进分离；（4 ）转移效率较高。其主要缺点是病毒载体对外源基因的最大容纳量只有 2500bp。目前常用的病毒载体有下列几种。逆转录病毒载体 逆转录病毒辣为 RNA 病毒，它们的基因组编码在一条单链 RNA 他妇上，病毒进入细胞通过逆转录作用，病毒 RNA 即转变为双链 DNA 分子，DNA 进入细胞核并整合在细胞染色体中，这种整合的病毒称为原病毒。在原病毒的两端各有一长
