1、微生物培养、药敏试验的流程及意义一、微生物培养及药敏试验的总述微生物培养就是使用体外试验的方法检测可能导致感染的病原菌，并给以药敏结果，为临床医生针对某一特定的临床感染提供依据。而药敏试验则是承接微生物培养的一项工作，即对于培养得到的病原菌进行体外试验检测细菌对于抗菌药物的耐药性，来预测抗菌药物的临床治疗效果，从而为临床医生提供选用抗菌药物的依据来治疗感染。对于检测到的可能的致病菌进行药敏试验时选择的药物是参照美国的 CLSI 推荐的标准制定的。尤其，使用全自动微生物分析仪进行药敏试验时有固定的药敏组合，不是人为可以随意添加或减少的。（一）微生物的培养和药敏试验的流程基本为：将标本进行处理（不
2、是所有的标本都需要处理） ；将标本接种于不同的培养皿中在不同条件的培养箱中进行培养（不同的标本所含菌的种类不同，不同菌的生长条件不同，因此需要接种于不同的培养皿中） ；24h 后观察培养皿中细菌的生长情况：a.此时若无细菌培养，继续放回培养箱中培养 24h，若仍然无细菌生长则判定为阴性结果，因此阴性结果出具的时间为 48h 以后。b.若有细菌生长，要根据形态和气味等对细菌进行初步的判定，若能判定出细菌的种类，则进行相应的药敏试验。贴有药敏片的培养皿在培养箱中培养 24h 后进行药敏结果的解读，然后报告结果，这种微生物培养及药敏结果报告出具的时间就是 48h 以后。由于不同的细菌的生长的速度不同
3、，有些细菌在培养 24h 后不能完全判定结果甚者24h 培养后无法观察到明显的细菌生长的则需要继续培养 24h，即连续培养 48h 后同样根据菌落的形态、气味等来观察判定细菌的种类然后进行药敏试验。这种微生物培养和药敏试验结果出具需要 72h 以后。而血液、骨髓等标本则是利用不同于上述培养方式的方法进行培养。它有专门的培养瓶和仪器。这种仪器会自动监测培养瓶中的变化来判定有无细菌生长，若有细菌生长仪器会发出警报。在培养 5 天内任何时间发出警报的培养瓶都要抽取瓶中的物质在培养皿中进行接种培养，同样在菌种鉴定后进行药敏试验；若在培养 5 天内不发出警报的培养瓶则视为阴性结果。因此血培养出具结果的时
4、间为 57 天。菌落的鉴定需要有雄厚的工作经验和熟练的相关基础知识。常规鉴定的方法有形态特征和理化特性。形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应和血清学反应。在微生物室学习时发现，很多时候在不太确定细菌的种类时，检验人员也会结合理化特性来判定细菌种类。（二）革兰氏染色、应用及意义由于微生物的生长有时间限定，因此微生物培养和药敏试验没有急查的说法。最快的结果也只能是通过涂片来判定有无细菌生长和细菌染色后的颜色和形态，来给临床医生的用药提供依据。革兰氏阳性菌和阴性菌因为细胞壁的结构不同，在革兰氏染色时染成不同的颜色。革兰氏阳性菌显示紫色、革兰氏阴性
5、菌显红色或粉色。由于细胞壁的结构不同，导致这两类细菌在染色性、抗原性、毒性、对某些药物的敏感性等方面均有较大差异。一般情况下，大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，而大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们差生内毒素，靠内毒素使人致病。在治疗上，大多数革兰氏阳性菌对青霉素敏感（结核杆菌对青霉素不敏感） ，革兰氏阴性菌对青霉素不敏感（但奈瑟氏菌中德流行性脑膜炎双球菌和淋病双球菌对青霉素敏感） ，而对链霉素、氯霉素等敏感。所以区分病原菌是 G+、G -，在选择抗菌药物方面意义重大。常见的 G+有：葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等；常见的 G-：大肠
6、杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、流感（嗜血）杆菌、卡他（摩拉）菌、不动杆菌属、那尔森菌属、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、副百日咳杆菌、志贺菌属、巴斯德菌属、霍乱弧菌、副溶血性杆菌、类志贺吡邻单胞菌等。涂片的原理就是将标本固定于玻璃片上，并进行革兰氏染色，然后在显微镜下观察染色情况和细菌的形态。是若有细菌生长，也只能判定是革兰氏阳性菌或者是革兰氏阴性菌。涂片是一种粗略的、快速的细菌鉴定的途径。经常被辅助用于细菌种类的鉴定，虽然通过这种方法无法给予具体的细菌的种类及药物耐药性。但是对于临床医生用药可以提供一个大致的方向。微生物标本有带菌体液和无菌体液两种类型。带菌体液包括：痰、鼻咽拭子、尿
7、液、粪便等；无菌体液包括血液、骨髓、脑脊液、关节腔积液、心包积液、胸腔积液、鞘膜积液、胸腹水等。在排除采集标本或其他操作过程污染之后从患者血液等无菌体液中检出的细菌一般都应视为病原菌。二、药敏试验结果的解读药敏试验为临床抗菌药物的选择有指导意义，正确地解读药敏报告单将会帮助我们更好地利用药敏结果来选择合理的药物及合适的剂量等。不同细菌进行药敏试验时选用的抗菌药物是根据美国 CLSI 标准来配备的。不同的药物会使用不同的药物组合，但总体上该标准将所选药物分为以下几类：-A 组：首选，常规试验和报告-B 组：首选抗生素，在下列情况下选择使用 细菌对 A 组抗生素耐药 病人对 A 组抗生素过敏 严重
8、感染或多部位、多种细菌混合感染 控制传染病流行-C 组：备选抗生素，在下列情况下使用 对一个或多个首选药耐药的地区流行株感染 对不常见菌感染的治疗 控制传染病的流行-U 组：包含某些仅用于或首选治疗泌尿道感染的抗菌药物因此，同一张药敏报告单中包含的药物有 A 组、B 组甚至可以有 C 组和 U 组；不同的标本检出同样的细菌，药敏报告单中的药物也不会相同。关于药敏报告单的解读，常见的问题及答案如下：1、我们想用的药物在药敏试验中没有做？可能是天然耐药可能是药物的敏感性被其他药物所预报2.为什么有的菌报告很多种药物，有的仅报告几种药物？报告的药物种类根据细菌种类的不同而有所不同，如铜绿假单胞菌报告
9、的药物较多，而嗜麦芽窄食单胞菌报告的药敏较少。3、是否能将所用的药都做药敏试验?没有必要：通过耐药机制和标志性药物可以预测其他抗菌药物的敏感性没有可能：不是所用药物都可以做药敏试验（需要药物在体外稳定，需要有操作标准和解释标准）4、在药敏试验报告中 MIC 越小的抗菌药物效果越好吗？如何根据 MIC 联合用药？感染菌对同一种药物的 MIC 越小，效果越好；不同种抗菌药物之间 MIC 无可比性；目前很多仪器报告的是检测折点，而不是真正的 MIC。5、培养阳性的细菌都需要用抗菌药物治疗吗？不是的；培养阳性感染，可能为污染（血培养） ，可能为定植（痰培养） ；任何结果必须结合临床情况进行评价（很重要
10、） ；感染部位的清创、引流、换药比使用抗菌药物更加重要；改善患者全身情况：器官功能支持，纠正酸碱平衡，电解质紊乱，低蛋白血症，高血糖等。6、选择药敏报告敏感的药物，为什么临床治疗无效？体外药敏试验只能预测体内治疗效果，并不等同；一般来说，耐药治疗无效；敏感治疗有效；可能不是真正的致病菌（污染或定植菌） ；细菌本身因素（如诱导耐药，生物被膜） ；感染部位与药代动力学因素；细菌的 MIC，给药剂量和用药方式；药敏试验药物中有些药物单独使用无效，但可以与其他药物联合用药；药物剂型及生物利用度（纯品、商品） 。7、涂片镜检结果与培养结果不吻合？涂片镜检是报告所有检见的细菌，而培养的目的是检出致病菌,因
11、此会产生涂片和培养结果不一致的情况；一些苛氧菌需在特殊的环境或培养基上才能生长，因此可能在培养后才能得到。8、取的明显就是脓液标本，为何鉴定报告为无菌生长？我们做的是有氧培养，脓液可能为厌氧菌感染。可能细菌被大量的中性粒细胞吞噬。9、鉴定结果明明写着四联球菌、革兰氏阳性杆菌，为何没有药敏结果？四联球菌为微球菌，一般不引起人体致病，为非致病菌，故考虑污染可能；药敏结果参照 CLSI 标准，目前革兰氏阳性菌没有参照标准，故暂不能做药敏试验，若需治疗可参照阳性球菌用药。10、一般培养不是三天出结果吗，今天第四天了怎么还没出来？一般培养经 48 小时后，即第三天出报告，若需分离致病菌的则第四天出报告。
12、11、今天的培养结果怎么与前天的不一样？取材是否规范。痰标本，有时选优势菌做，就可能导致两次不一样。12.明显稀便，培养结果为何正常？大便普通培养，通常只能鉴定志贺菌、沙门菌感染，致病性大肠杆菌我们没有鉴定血清；怀疑霍乱时，需开霍乱弧菌培养；可能病毒感染(轮状病毒)。三、微生物标本及常见致病菌1.血液标本血液标本的细菌培养是诊断菌血症或败血病的基本方法。正常人的血液是无菌的、如从患者血液中检出细菌一般应视为病原菌(排除采集标本或具他操作过程污染 )，提示有菌血症或败血症，或心内膜炎、心包炎、血源性骨髓炎。常见的病原菌主要有金黄色或表皮葡萄球菌、链球菌(A、B群，肺炎链球菌等)、肠球菌、产单核细
13、胞李斯特菌、脑膜炎奈瑟菌、伤寒及副伤寒沙门菌和厌氧菌等。2.骨髓标本正常人的骨髓是无菌的。若从患者骨髓中检出细菌(排除污染)，提示细菌性骨髓炎或菌血症、败血症。常见病原菌同血液培养。检验方法和报告方式同血培养。3.脑脊液标本脑脊液的细菌学检查对于细菌性脑膜炎的诊断有重要的临床价植。正常人的脑脊液是无菌的，检出细菌提示有细菌性(急性化脓性、结核性等)脑膜炎。常见的病原菌主要有脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、链球菌( A、B 群和肺炎链球菌)、葡萄球菌、产单核细胞李斯特菌、结核分枝杆菌等。4.痰标本痰标本的细菌学检查对于呼吸道感染的诊断有重要意义。下呼吸道的痰液是无细菌的，而经口腔咳出的痰带有多种上呼
14、吸道的正常寄生菌(如草绿色链球菌)。若从患者痰标本中查见致病菌或条件致病菌，提示有呼吸道细菌感染。常见的病原菌主要有肺炎链球菌、A群链球菌、金黄色葡萄球菌、卡他布兰汉菌、白喉捧状杆菌、结核分枝杆菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、肠杆菌和军团菌等。5.咽拭标本咽拭培养对于上呼吸道的细菌感染有一定的诊断意义。正常咽拭有多种上呼吸道的正常菌群(如草绿色链球菌)。若从患者咽拭标本中查出致病菌或条件致病菌提示上呼吸道有细菌感染(如急、慢性扁桃体炎，咽炎，喉炎等)。常见的病原菌主要有金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、微球菌和棒状杆菌等。6.泌尿、生殖道标本尿液通常是无菌的或一过性有少量微生物，但是
15、尿道内或尿道周围皮肤的菌群会污染尿液标本，从而可能导致错误的培养结果。中段尿培养加计数对于泌尿道感染的诊断有重要价值。细菌培养必须结合菌落计数辨别是否为病原菌。有致病菌或条件致病菌生长，菌落计数10 5/ml，提示感染（膀胱炎，肾盂肾炎、肾或膀胱结核等）。常见病原菌主要有大肠埃希菌、葡萄球菌、链球菌、变形杆菌和伤寒沙门菌等。尿标本包括清洁中段尿、导尿导管尿、经耻骨上皮肤穿刺采集膀胱内尿液。正常的内生殖器是无菌的，而外生殖器（包括男性尿道口和女性阴道）有多种细菌寄生。查见病原菌提示有细菌感染。常见的病原菌主要有葡萄球菌、肠球菌、链球菌、淋病奈瑟菌、大肠埃细菌、变形杆菌等。7.粪便标本正常情况下肠
16、道中有多种细菌。引起感染性腹泻的病原微生物有：细菌性：产毒素型腹泻、侵袭型腹泻、食物中毒、慢性腹泻；真菌性；病毒性。8.穿刺液标本各个部位穿刺液(胸水、腹水、心包液、关节液及鞘膜液等)的细菌学检查对于确定该部位是否有细菌感染具有诊断价值。正常穿刺液是无菌的，若从患者穿刺液中查见致病菌或条件致病菌提示该部位有细菌感染。胸腔感染的病原菌以结核分枝杆菌多见，其次是金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌等;腹腔感染的病原菌以肠道细菌如大肠埃希菌、粪肠球菌，以及结核分枝杆菌多见。心包炎和关节腔液以金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌等多见。9.脓液及创伤感染分泌物标本脓
17、液的细菌学检查对于确定感染的种类(结核性或非结核性等)、提供药物敏感结果、指导临床治疗有重要的意义。化脓性感染可由单种或多种细菌引起。常见病原菌主要有金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌和肺炎链球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌和结核分枝杆菌、诺卜菌。以及梭杆菌和拟杆菌等。四、微生物检验标本的正确采集、运送及处理微生物检验标本的正确采集、运送及处理，与细菌的培养、鉴定结果有十分密切的关系，医生、护士、检验人员均应重视微生物标本的正确采集的有关问题，并有责任向患者及家属进行正确采集标本的宣传和指导。（一）微生物检验标本采集、运送、验收1、标本的采集 不同的标本在采集时会在技术、方法和量方面的内容有
18、所不同，但是最基本需要遵循的是以下几项：（1）申请单必须标记清楚姓名、性别、年龄、病原号、标本来源（具体写明） 、检查项目（目的要明确）等，以便试验室能够合理选择培养环境和培养基。（2）尽量在抗生素应用前采集标本、以提高阳性检出率和避免漏检。（3）标本采集应严格执行无菌操作。（4）采集标本的容器必须经灭菌处理，不可用消毒剂。2、标本运送（1）标本采集后应尽快运送到细菌室。（2）标本采集后在室温下超过 2 小时未送到细菌室的，可视为不合格标本。3、标本验收（1）实验室只接受和处理合格标本。（2）实验室对不合格标本退回必须说明原因、并及时与临床联系。4、注意事项（1）微生物检验样本必须要求采集转运
19、，否则将影响检查结果，并给评价其意义带来麻烦甚至误导。（2）微生物样本极易被污染，污染的样本杂菌大量繁殖抑制病原菌生长，条件致病菌也是致病菌，如污染条件致病菌将误导临床，造成对患者的损害以及经济和时间的浪费。（3）某些标本离体极易死亡，应在床边采取和接种或立即保温送至实验室检验。室温放置或延迟送检，可使检出的阳性率降低；不能使用冷藏的样本检验。（4）厌氧菌样本采取必须隔绝空气，混入空气的样本影响检验结果，不能使用。（二）微生物检验标本处理1、血液及骨髓标本最常用的方法为血液增菌培养法。成人每瓶需 810mL,儿童每瓶需 13mL。另外，脑脊液和胸腹水也可用儿童血液培养瓶增菌，采集量同血液。（1
20、）为了提高阳性率，应在抗生素治疗前，病人寒战或高热时严格无菌静脉采血后注入血培养瓶。（2）于已用抗生素不能停用时，可于 48 小时内分别于下次用抗生素之前，采取 3 份血液标本( 要求双管双侧）立即送检，如不能立即送检，应放置室温保存，但不能超过89 小时。（3）必要时可取骨髓 12mL，无菌注入血培养瓶中送检。注意：应严格无菌操作避免污染。一般病人在发病初期 12 天或发热高峰时采集血液保本。2、痰及下呼吸道标本注意事项：痰经过口腔，所以患者应用清水漱口数次，尽量排除口腔内大量杂菌。（1）自然咳痰法：以晨痰为佳，用冷开水漱口后用力深咳出肺部的痰，吐至无菌容器中送检，痰量不得少于 1mL。（2
21、）小儿取痰法：用弯压舌板向后压舌，将拭子深入咽部，小儿因压舌板刺激引起咳嗽，喷出的肺或气管分泌物粘在拭子上即可送检。（3）支气管、支气管穿刺、支气管肺泡灌洗等采集法，均由医生操作。其中气管导管法：气管插管吸取下呼吸道痰液。（4）呼吸道标本采集方法：鼻咽拭子法，清水漱口后，用压舌板压舌根，用棉拭子在病人咽后部涂抹数次，放入无菌管中立即送检。3、尿液标本通常留取晨尿，尿液采集后要及时送检，并保证 2 小时内接种；不能及时送检和接种时，尿液应置 26冰箱保存并于 8 小时内接种。（1）中段尿采集法：成年男性和女性分别用肥皂水或 1：1000 高锰酸钾水溶液清洗尿道口和外阴部，再用冷凉白开水冲洗，排尿
22、时弃去前段尿，收集中段尿 1020ML 置于带盖的无菌容器内立即送检。（2）导尿法：用导尿管留取 1020ML 尿液置无菌容器中;长期留置导尿管者应更换新导尿管留尿，留置导尿时，用无菌消毒法消毒导尿管外部及导尿管口，用无菌注射器抽取尿液送检（不可采集尿液收集袋中的尿液送检） 。4、粪便（1）采集时间：腹泻患者于急性期，尽量在用药前采集粪便。伤寒患者于发病 2 周后采集粪便。怀疑霍乱时立即采集粪便送检。（2）采集方法：自然排便法：取新鲜粪便的黏液、脓血等有意义成份 2-3 克或 1-2ML，置于无菌容器中送检。直肠拭子法：难以获得粪便或排便困难者及幼儿采用此法。5、脑脊液标本（1）采集时间：怀疑脑膜炎时应立即采集脑脊液，最好是在应用抗生素之前采集脑脊液。（2）采集方法:无菌腰穿采集脑脊液 13mL 注入血培养瓶中。6、穿刺液标本（1）穿刺液标本包括胸腹水、关节液等。（2）无菌操作穿刺抽取标本1mL 立即送检。7、胃液及胆汁：抽取 5mL 左右后置于无菌管中立即送检。8、深部脓液：用无菌注射器抽取后立即送检。9、皮肤（主要指伤口、创面等）标本（1）对采集保本部位清洗、消毒后再采集。（2）封闭性脓肿：用无菌注射器抽取。（3）开放性脓肿及脓性分泌物：先做局部消毒再用无菌棉拭子采取脓液及分泌物置于无菌试管中送检。
