1、动物细胞培养和核移植技术,专题2 动物细胞工程,动物细胞培养,动物细胞融合,生产单克隆抗体,动物细胞核移植,动物细胞工程常用技术,其中动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。,动物细胞培养概念：,动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖。,1.为什么要培养动物细胞？2.要培养动物细胞，对取材有何要求？,实验材料，药性、毒性检测，提取细胞分泌物等。,选择胚胎细胞或幼年动物组织，因为其分裂增殖能力强。,3.培养基是用液体的还是固体的？培养基中的成分有何特点？,培养基是液体的，成份与动物内环境相似。 动物血清,4.动物细胞培
2、养条件有何特点？,体温和PH都应与动物体内环境相似。,1.动物细胞培养过程,胚胎或幼龄动物的组织器官,细胞悬液,10代细胞,50代细胞,剪碎,胰蛋白酶或胶原蛋白酶,洗涤、稀释、分离,原代培养,用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。动物细胞培养适宜的PH为7.27.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。,比老龄动物的组织细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛。分化程度越低，繁殖能力越强，越容易培养。,动物细胞培养不能最终培养成生物体,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,贴壁生长接触抑制,1
3、0代以内，保持正常二倍体核型,传代培养,笔记,动物细胞的培养过程,幼龄动物,取动物器官和组织,剪碎组织,胰蛋白酶处理,细胞培养,单个细胞,动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。,思考讨论：在动物细胞培养过程中，为什么要用胰蛋白酶对取出的动物组织进行处理？,胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的胶原纤维和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。,有关概念:,原代培养：指将要培养的动物细胞取出后,先用胰蛋白酶等使组织分散成单个细胞,然后配制成一定浓度的细胞悬浮液，再将该悬浮液放入培养瓶中培养。,传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，
4、称为传代培养。,细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。,细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。,细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。,如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系？,遗传物质改变,贴壁生长细胞分裂生长到相互接触时就停止分裂增殖的现象叫接触抑制,1、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液）2、营养（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血
5、清等。）3、温度和PH 36.5+（-）0.5度, 7.2-7.44、气体环境： O2和CO2（95%空气和5% CO2 ）,2.动物细胞培养条件：,保证细胞顺利的生长增殖,(三) 动物细胞培养的条件P46,1、无菌、无毒环境（无菌处理和添加抗生素目的？更换培养液的好处？）,2、营养与体内相同。合成培养基：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，通常需加入血清、血浆等一些天然成分。,3、温度和PH，3637、7.27.4）,4、气体环境95%空气、5%CO2-维持培养液PH）,3.动物细胞培养技术的应用,1.蛋白质生物制品的生产如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体2.健康细胞培养培养健康细胞用于
6、烧伤病人皮肤移植3.细胞的生理、药理、病理研究,动物细胞培养液的主要成分：,葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。,与植物培养基相比其特点是：,（1）液体培养基,（2）含有动物血清,动物体细胞大都生活在液体的环境,笔记,细胞的全能性,细胞增殖,植物组织培养和动物细胞培养的比较,固体培养基,液体培养基,蔗糖 植物激素,葡萄糖 动物血清,植物体,细胞株、细胞系,快速繁殖、培育无病毒植株,获得细胞或细胞分泌蛋白,既然动物体细胞核仍具有全能性，为什么不能直接利用动物体细胞培育动物体？,想一想,利用动物体细胞核移植技术,动物细胞的全能性会随着动物细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能逐渐变弱。
7、,怎样才能使动物体细胞表现出全能性呢？,二、动物体细胞核移植技术 和克隆动物,动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中。使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。,克隆动物,用核移植方法得到的动物,1、动物核移植：,无性生殖,2、为什么不是取供体细胞核进行核移植操作，而是直接将供体细胞整个注入去核卵母细胞中？,保证供核不被破坏，使所得个体的性状更符合供体。,想一想,1、受体细胞为什么选用卵母细胞？,卵母细胞体积大，易操作，而且含有促使细胞核表达全能性的某种物质和营养物质。,2.体细胞核移植的过程,供体细胞（供核）,细胞培养,体细胞,卵巢卵母细
8、胞（M中期：供质）,去核,无核卵母细胞,注入,细胞融合,重组细胞,构建重组胚胎,胚胎移植,代孕母体,生出与供体奶牛遗传基本相同的犊牛,归纳:1.共分成两大阶段：核移植和胚胎移植2.取卵细胞作受体细胞的原因是:它是最大的细胞,易操作,它发育可直接表达性状3.严格来说新个体有卵巢母细胞的细胞质所以有两个亲本的性状,核移植过程,2.体细胞核移植技术的应用前景,1、在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程.,2、保护濒危物种.,3、医药卫生领域生产医用蛋白质及组织器官的移植.,克隆动物的研究意义,1.克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白2.改良动物品种 3.治疗人类疾病，作为供体4.保护濒危动物,3.体细
9、胞核移植技术存在的问题,许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，免疫失调等。成功率非常低及克隆动物食品的安全性问题。,体细胞核移植技术存在的问题,许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。 在研究方面，克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。在应用上，生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。,思考：,2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？,1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？,、动物
10、细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？,主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处有：液体培养基 成分中有动物血清等,因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强,不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体,P49 讨论：,为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。,1.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？,2.用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？,培养的动物
11、细胞一般当传代至1050代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。,1.动物细胞培养要经过脱分化吗？为什么？2.体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？,反馈,克隆动物绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。所以，用教材中所述的方法克隆的动物不是供核动物完全相同的复制。 此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境
12、有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。,动物细胞的培养有各种用途，一般而言，动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。,动物细胞培养和核移植技术,知识结构,动物细胞培养,动物体细胞核移植技术和克隆动物,核移植技术和克隆动物的概念,体细胞核移植技术的过程,体细胞核移植技术的应用前景,体细胞核移植技术存在的问题,细胞核移植,多莉羊的培育过程,核移植技术,1、动物细胞培养过程,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,细胞悬浮液,胰蛋白酶,10代细胞,原代培养,传代培养,无限传代,单个细胞,加培养液,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,（水解弹性纤维）,
