1、Western Blot 显色篇WB 蛋白印迹在生物化学这一块是常规实验，就像有人说炒菜中境界最高也最难的是蛋炒饭一样，实验中常规实验也是很考验技能的，除了潜心研究原理、认真揣摩技巧以外，对于新实验试剂的信息把握，勇于尝试新方法也是非常之重要的各大厂家都在不断开发更方便更灵敏的新产品，“idea 是生产力”嘛，因此生物通这里介绍一些能把我们从日常操作中解脱出来，获得“升级版”效果 WB 产品。讲完了 Western Blotting 的电泳转移仪器，蛋白分子量标准和转移膜之后，我们最后来探讨一下 WB 的检测系统。一般的 WB 检测过程中，都会有封闭、一抗、二抗和底物显色这四道工序要“加工”。
2、我个人觉得底物显色这最后一步是最关键的，也是最有文章可以作的一个部分。你看，光标记方式就有生物素标记，地高辛标记，各种酶标记等等，酶标的底物又有各种生色底物、化学发光法底物和荧光底物可供选择；就连识别一抗的配体也不一定非要二抗不可，也可以是抗生物素蛋白，链亲和素或者 Protein A 或 G 等，更别说各种试剂盒琳琅满目，叫人好像无从下手！不过不急，生物通帮你作个参考，让你对各种产品的优点缺点一览无遗，真正成为一个 WB 高手。另外如果实验室有已经建立的固定的显色方法，那也没关系，有时候不经意浏览到的方法可能就会对你的实验有莫大的帮助这也就达到我们的目的了。 与蛋白质组学一线专家面对面，赶快
3、报名参加第二期蛋白质组学技术与应用高级培训班！封闭和一抗的选择没有太多的选择余地封闭前面介绍过了；一抗？现在的抗体产品说明书一般都有注明应用范围的，说明可以用于 WB 的就 OK。如果没有这些信息可以遵从以下原则：单抗专一性高，但是经过 SDS-PAGE 变性胶电泳的蛋白质可能由于原来的识别位点构象发生改变而不被识别，多抗不如单抗专一性高但更容易得到结果。如果还有多种抗体选择，那当然是来源于兔或者小鼠抗体为好，因为后继的检测试剂盒一般都是针对兔鼠的居多，因而选择范围更大通用性也更强。除了无标记的一抗，还有生物素等各种标记一抗。还听说有用荧光标记的一抗直接检测而降低背景和非特异结合，不过由于少了
4、二抗的级联放大信号扩增，信号也会比较弱，所以需要选择荧光信号特别明亮的标记（Invitrogen 收购了著名的 Molecular Probes 后有推出 Alexa Fluor 的抗体标记试剂盒，生物通这里有详细而精彩的介绍，我们就不罗嗦了。毕竟不是 WB 的主流方法。）一抗的稀释度通常需要预实验摸条件，可以根据说明书上建议的 WB 稀释度附近做 23 个梯度，如果是用化学发光法检测，由于灵敏度高而建议将稀释度再放大一些。二级试剂的作用是信号扩增，选择是根据一抗的标记形式而决定的，对于无标记的一抗，可以选择对应一抗来源种属的标记二抗，或者更便宜的标记蛋白 A（来自金黄葡萄球菌 Protein
5、 A 可以高度亲和来自人，兔，豚鼠的 IgG，但对大鼠、山羊和鸡的 IgG 亲和力弱）。不过，二抗是更可靠的选择除了要选择对应一抗的来源种属，也要根据你准备采用的检测方法选择合适的标记。酶促反应比同位素安全且快速，已经成为 Western Blot 的主流检测方法。酶促反应可以搭配不同的底物从而实现不同的显色方法：化学发光 Chemiluminescent 和底物显色Colormetirc/Chromogen，前者灵敏度很高随着各大厂家努力开发研制灵敏度更高的发光底物，化学发光法的灵敏度已经达到 pg 级别，甚至还有 Femto 级别的，灵敏度超过了同位素；而后者由于直接显色而操作简便且成本低
6、。最为大家熟悉当数辣根过氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase，属于过氧化物酶 POD 类）和碱性磷酸酶 AP（Alkaline Phosphatase），此外还有比较少见的葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）、 半乳糖苷酶-Galactosidase。 . HRP 辣根过氧化酶是最常见的酶促发光或显色的交联酶，由于 HRP 比活高、特异性更强、分子量小（40kD）、稳定和作用底物范围广的优点而得到广泛使用。HRP 的底物种类有不少，主要可以分为化学发光底物和生色底物 2 大类。对于底物的选择，主要考虑的是灵敏度、背景和使用的方便性和稳定性比如底物可溶性高使用就
7、比较方便；对于 WB 来说产物不可溶有助于信号在原位的积累和结果的稳定（产物可溶的底物更适合于 Elisa）。 HRP 的生色底物显色有 DAB，4-CN ，CN/DAB，AEC 和 TMB 等（而得到可溶性产物的底物如 OPD，ABTS 等则适用于 ELISA）中，与化学发光法中的酶促基团发光不同，底物显色主要是利用底物在有 HRP 和过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化积累这一过程检测 WB 的结果。 底物 DAB 4-CN AEC TMB 学名 3,3- 4-chloro-1-naphthol 3-amino-9- 3,3,5,5diaminobenzidine tetrahydro
8、chloride ethyl carbazol tetramethylbenzidine 分子量 214.14 178.58 210.28 240.4 稳定性 好 一般 避光 好 灵敏度 250pg 1ng 100pg 背景 一般 低 高 高 终产物成像性 不能很好的成像 容易成像 容易成像 颜色 褐色 介于蓝色与蓝紫色之间 （可用于 double-staining） 棕红色 蓝紫色 毒性 有（疑有治癌作用） 无 有 无 最熟悉的底物应该是 33二氨基联苯胺 DAB，DAB 可以和 HRP 作用形成褐色不溶性产物，灵敏度高，特异性好，缺点就是需要现配现用，显色后光照数小时会褪色，不能永久保存，
9、需要拍照记录，而且有毒。DAB 的选择有一点小小的技巧33二氨基联苯胺 4 盐酸盐的纯品分子量为 360.1，通常是深棕色粉末，不太好溶于水，容易得到有色颗粒的溶液而导致膜上的背景，而且价格还被炒得贵；但是如果选择 2 水合 33二氨基联苯胺 4 盐酸盐（分子量396.14）就是白色粉末状晶体，易溶，溶液无色均匀，量大价格还便宜。DAB还有溶剂形式的，便于使用。由于 DAB 显色是褐色，不如 4-CN 反差大容易拍照，有的厂家还推出了 DAB+4-CN 混合底物，结合了 DAB 灵敏度高和 4-CN 背景低，易成像的优点，能获得很好的黑色沉淀成像。用金属离子增强信号的 DBA 显色试剂灵敏度可
10、以高达 20pg。TMB 的 signal-to-noise 信噪比高，成分安全，特别合适于灵敏度要求高的 WB，但是也要避免由于灵敏度高而引起的高背景，因此可以相应的延长封闭的时间和注意洗涤的次数；ACE 各方面性质与 DAB 相似，但灵敏度要比 DAB 差一点。 HRP 化学发光反应底物经过多个著名厂家的不断研究开发而有了更显著的改进。Luminol 是经典的 HRP 化学发光底物。化学发光底物主要考虑的是：发光信号强弱发光信号当然越强越好，强发光信号持续的时间也是越长越好，还有就是背景低灵敏度高。化学发光法由于仅在酶和底物都存在的时候才会发光，不同于生色反应般形成不溶的产物于膜上累积，所
11、以特别适合同一张膜对不同的目标蛋白分别进行多次检测。目前最高检测灵敏度已经达到低飞克（Femto）级别而成为安全且灵敏度最高的 WB 检测方法。随着Cooled-CCD 技术的发展，成像系统成本越来越低，因而在现在的实验室里这些设备越来越普遍。Cooled-CCD 照相机与 X 胶片相比具有瞬时影像处理、立即输出、不需要胶片处理装置及暗室等成本花费、可用软件半定量分析等优点，然而，这项技术应用于 WB 化学发光法显影还要求底物能产生高强度、长持续时间的信号，以被照相机捕获到。经过各大厂家的不断开发，现在的化学发光检测试剂从以前的发光时间持续几十分钟，到现在多数试剂可持续长达几个小时到一天，新的
12、化学发光检测试剂盒很多兼容 CCD 成像检测，如果是实验室有 CCD 成像设备的不妨留意试剂盒是否有这种说明。发光时间的延长即使对于 X 底片的用户也是好消息因为压片显影后如果发现压片结果不理想，还可以多次重复压片而不需要重新反应。 化学发光的常见问题主要是抗体浓度过高所以抗体用量要比规定的稀释倍数放大许多，确保 HRP 不会过量导致底物过快消耗完而引起结果不稳定。GE Healthcare（原安玛西亚）的 ECL 堪称是经典，ECL 在许多研究人员心目中的几乎成为化学发光法的代名词，有时竟然是高品质文章的保证之一，可见其经典。后来推出的ECL Plus 和 ECL Advance 不单将检测
13、灵敏度提高了 1020 倍，发光时间也长达 24 小时以上，兼容 CCD 成像系统的检测，使得 ECL 系统继续领导潮流。前不久 GE Healthcare 公司在生物通上发布了 ECL 全系列的 65 折特价优惠，价格相当吸引，对于 ECL 的忠实粉丝们实在不该错过。ECL Advance ECL ECL PlusRecommended applicationsHighest sensitivity Western blotting primary antibody and/or target is very low abundanceRoutine Western blottingHigh
14、 sensitivity Western blotting and chemifluorescent detection on scannersSensitivityUp to 10 times greater than ECL PlusUp to 10-12gUp to 20 times greater than ECLAntibody economy Outstanding Good Very GoodPrimary antibody Up to 1:100 000 Up to 1:10 000 Up to 1:20 000Secondary antibody Up to 1:500 00
15、0 Up to 1:15 000 Up to 1:200 000Blocking Agent includedYes-ECL Advance Block Certain systems Certain systemsSimple reprobing protocolsYes Yes YesEmission duration 4-6 h 1-2 h 24-18 hRecommended membraneHybond-P or Hybond ECL Hybond ECL Hybond-PRecommended detectionHyperfirm ECL/CCD Hyperfirm ECL/CCD
16、Fluorescent Scanner/ Hyperfirm ECL/CCD虽然延长信号持续时间让研究人员能充分利用成像系统的所有特点，但低极限的灵敏度才是研究者期望的终极目标。除了拥有王牌产品 ECL 的 GE 公司，化学发光底物方面不得不提到 Pierce 公司。Pierce 形象广告十分有趣鲜明：用不同色彩的手掌印来表示 Pierce真的很有一手:）。这家已经有半个世纪历史、在蛋白质化学领域声誉卓著的的公司 6 年前与 HyClone 合并，拥有世界上最优秀的 HRP 化学发光底物生产技术世界上许多知名的化学发光底物试剂盒厂商都采用 PIERCE 提供的化学发光底物作为生产原料。其中最耀
17、眼的璀璨之星是 SuperSignal 系列，就像印证上面我们提到的选择显色系统的标准一样，SuperSignal 灵敏度高（有 10-12g 级，10 -14g 级，10 -15g 级选择），发光持久（6-24 小时），可反复曝光，稳定性好（室温贮藏 6 个月，4至少是 12 个月），节约抗体（由于灵敏度高，一抗二抗稀释倍数是同类产品的 10 倍以上，这对于宝贵一抗来说十分重要）。让人几乎无法从中挑出毛病来，如果说有的话，当然就是希望便宜一点，再便宜一点罗。另外需要提醒的是抗体一定要比底物显色法中稀释更多倍数，不然过于灵敏（背景高）可不能怪 Supersignal 哦，还有记得不能拿叠氮钠来
18、当防腐剂因为叠氮钠会抑制 HRP 的作用。除此之外也要注意 Pierce 提供的溶液要用棕色瓶避光保存。Pierce 的很有一手不仅仅于此，还有更好玩的东西不用转膜直接在 PAGE 胶上做 Western Blot 的好东西！且看生物通后面慢慢介绍。SuperSignal West Pico 化学发光底物SuperSignal West Femto 超灵敏型底物SuperSignal West Femto 增强型底物主要优点与 ECL 系统相比减半的价格、双倍的信号适用于 HRP 检测的最灵敏的化学发光底物延长的信号持续时间使这种底物用于今天的成像设备最为理想检测下限 10-12g 10-15
19、g 10-14g信号持续时间 6-8 小时 8 小时 24 小时首选检测方法 X 胶片 成像设备或 X 胶片 成像设备或 X 胶片建议一抗稀释度 1:1000-1:5000 1:5,000-1:100,000 1:1000-1:50,000建议二抗稀释度 1:20,000-1:100,000 1:100,000-1:500,000 1:50,000-1:250,000产品保存期 室温 1 年 41 年或室温 6 个月 室温 1 年建议印迹膜 硝化纤维 硝化纤维或 PVDF 硝化纤维或 PVDFWestern Blot 检测系统中常用交联酶两大家族中的另外一类就是 AP碱性磷酸酶。碱性磷酸酶很早
20、就被用于检测系统包括固定化抗原（WB）检测和核酸检测。但是做过 AP 实验的经常会遇到膜上显色背景偏高的问题，所以就 WesternBlot 本身来说偏爱 HRP 的要比AP 多分子克隆 III 解释说由于在我们常用的封闭剂：脱脂奶粉和牛血清白蛋白 BSA 中富含 AP，这样当然显色背景会高。所以分子克隆 III 推荐的 AP 适用封闭剂是 6%的酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmo lEDTA 65 度加热一小时确保 AP 失活后再用于封闭。一些研究的样本自身也含有较高水平的碱性磷酸酶，虽然实验上很容易实现抑制内源 AP 影响，但实际上容易被忽略。AP 显色底物生成的产物主要是蓝紫色，成像
21、性好容易拍照。早些年前，AP 检测的灵敏度比 HRP 高，但是背景也偏高，整个显色过程更有“技术性”，有许多个人技巧在里面，让人取舍两难。如今由于 HRP 系的化学发光底物已经不断改进而使得灵敏度不断提高，化学发光显色上 HRP 和 AP 不相上下，但是生色反应来说，AP 显色的灵敏度还是比一般的 HRP 显色底物要高。AP 作为一种经典常用的显色交联酶，自有其优点，比如 AP 的底物显然更稳定，不像HRP 那样需要新鲜配制的 H2O2 一类的不稳定成分，作为试剂盒可以保存时间更长，也自有一批忠实的”粉丝”（fans），特别是习惯用显色方法检测 WB 结果的。就像 HRP 可以用于化学发光和底
22、物显色一样，AP 也有这两种常用的检测方法的不同底物。AP 显色的灵敏度就已经可以达到低皮克级，前提是封闭要做得好。常用的是 BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyphosphate p-Toluidine Salt) ，NBT (Nitro-Blue Tetrazolium Chloride)和INT。 与蛋白质组学一线专家面对面，赶快报名参加第二期蛋白质组学技术与应用高级培训班！BCIP NBT BCIP/NBT BCIP/INT 学名 5-Bromo-4-chloro- 3-indolyl phosphate, toluidine salt nitro-blue t
23、etrazolium chloride 作用 与 O2 反应形成沉淀 氧化反应 BCIP 除了可以和 O2反应，也可以用 NBT作为电子受体 氧化反应 灵敏度 100pg 100pg 30pg 一般 沉淀颜色 紫色 蓝紫色 蓝紫色 棕红色 用途 AP 显色 AP 或者葡糖氧化酶 AP，原位杂交和免疫组化 AP 和免疫组化 几乎出显色剂的厂家都会生产到这几种底物，比如 Roche 的 BCIP 和 INT/BCIP ，Pierce 的 BCIP/NBT，其中以 BCIP/NBT 灵敏度最高，显色也比较锐利，成像性比较好，因此也就最常用到。预配的即用型显色底物不存在颗粒性底物，较少产生斑点背景。N
24、EB和 Invitrogen 也有完整的检测试剂盒。还有一些比较特殊的各家的“法宝”，这里要拿出来“显摆显摆”。比如 Pierce 公司的 Fast Red 是为 Western 印迹，点印迹和免疫组化过程中检测 AP 而专门设计的，这种底物产生的是亮红色沉淀，经过优化，灵敏度高，其中最有趣之处在于其双染色的好处：由于这种亮红色沉淀可以与不溶的 HRP 底物沉淀无论是 NC 还是尼龙膜上都能形成醒目的对比，因此可以进行两次显色，检测不同的蛋白。但是要注意的是 Fast Red 要比 HRP 底物先加，以防背景颜色加深（Fast Red 可能有毒，小心操作哟）。AP 的化学发光底物可以说是未来创
25、造 WB 化学酶联底物灵敏度“神话”的希望所在由于 AP 在催化脱磷底物方法时转换数高（转换数：每秒钟每个酶分子催化底物转变为产物的量，是酶效率的一个测量单位），可快速产生强信号，因此可以获得非常漂亮灵敏的 WB 结果，而且不需要像生色底物那样等待半小时才能看结果。Invitrogen 的 WesternBreeze 就是检测灵敏度达到 Femto 飞克级别的 AP 化学发光法检测试剂盒，而且发光持续时间长达 5 天！真可谓是 AP 发光显色中的“恒星”。迅速、安全，灵敏度可比同位素，兼容成像系统，再加上优化后的极低背景，WesternBreeze 几乎可以解决你所有的顾虑。而另一个又是来自
26、Pierce 公司的产品Lumi-Phos Wb 也是 AP 化学发光的代表之作，因为 Lumi-Phos 的灵敏度可以达到低 pg 级1.2pg（小鼠 IL2 为例只需要 71 attomoles，10 18 mole)， Lumi-Phos 都可以帮你检测出来，另外适用这种检测方法的膜还包括尼龙膜这是许多化学发光底物所不兼容的（尤其是 ECL 之类高灵敏度的检测方法），可见其信噪比是特别优化过的。Lumi-Phos Wb 的发光持续时间是 8 个小时（2 小时内光最强）（据说现在 Pierce 正在打特价，要赶快行动哦）。除了生色底物和化学发光底物，AP 的荧光底物也很有特色。Invitr
27、ogen 的 Pre-Q western blot stain kit，是用 AP 的荧光底物 DDAO 来显色的，检测灵敏度达到 2ng，堪比一般的化学发光检测试剂盒。这个荧光底物的好处在于，经过 AP 分解后得到的红色荧光产物是稳定的，不会因为底物用完而消退，不需要暗房或者压片，干噪后的膜上更明显，在紫外或者扫描仪上可随时检测。AP 的还有一种用于荧光发光检测的 AP 底物AttoPhos Substrate（Promega），主要用于 Elisa 的检测。荧光底物是不同于前两者的酶促显色系统，其最大的优势就是灵敏度(吸收值稳定为前提)，这种来源于生物的显色物质不仅可以避免化学物质的毒性，而且显色时可以在低背景的前提下达到 0.1 attomole 显色级别。这算是体外话了。另外还有一种不常用的耦联酶- 半乳糖苷酶，它的底物中有一个在克隆筛选中鼎鼎大名的化学物质：x-Gal，它与 半乳糖苷酶反应可以形成一种蓝色沉淀，因此被用于免疫杂交分析中，但是由于不如前两种酶显色灵敏和方便，所以没有这么常用到。
