1、1赤芍总苷的提取纯化与质量检查设计方案1 文献背景赤芍为毛茛科植物芍药 Paeonia lactiflora Pall. 或川赤芍 Paeonia veitchii Lynch 的干燥根，具有清热凉血、散瘀止痛的功效，其主要有效成分为芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药花苷等单萜苷类化合物，总称赤芍总苷，可改善机体微循环，抑制血小板凝聚，抗血栓形成，具有广泛的药理活性 1-3，是一种可用于保健食品的中药。1.1 赤芍总苷背景意义在药理学上，赤芍总苷对血液具有抗凝血、抗血栓以及抗内毒素和改善微循环的作用。并且赤芍总苷对缺血性损伤如心肌缺血同样具有保护作用 4，正是这样的良好使用疗效
2、，我们需要对赤芍总苷进行更多的研究，来保证临床的使用疗效。1.2 提取研究现状目前报道的赤芍总苷提取工艺文献中，多采用正交试验设计法 5。即分别称取赤芍药材若干（通常 800g），以不同的提取液（水、乙醇）分别按正交试验设计表试验，滤过，合并滤液，量取体积，即得正交试验各试验的提取液。1.3 纯化研究现状目前报道的赤芍总苷纯化工艺文献中，多采用正丁醇萃取法和大孔树脂吸附法 6。即将提取过程中，包括糖类、脂类等许多杂质在内的浸膏提取液，补充蒸馏水至药材的 2 倍量，作为待纯化样品溶液。纯化方法 1（正丁醇萃取法）：取上述待纯化样品溶液 200ml，取等量石油醚萃取 3 次，除去石油醚层，然后用水
3、饱和后的正丁醇萃取 3 次，收集正丁醇层，再用 200ml 蒸馏水洗 1 次，弃去水层，减压回收正丁醇，所得浸膏于真空干燥器中干燥。纯化方法 2（大孔树脂吸附法）：D101 大孔吸附树脂 100g，经 95%乙醇浸泡 12h，充分溶胀后装柱，蒸馏水洗至无醇味，备用。上述待纯化样品溶液取200ml，上树脂柱，3 倍量蒸馏水洗，再用 3 倍量的乙醇洗脱，收集 20%洗脱组分，减压回收乙醇，剩余浸膏于真空干燥器中干燥。1.4 质量控制2赤芍中赤芍总苷质量控制包括性状鉴别（颜色、气味）、薄层鉴别（蓝紫色斑点）、以及对其进行高效液相色谱的含量测定（检测波长为 230nm，理论板数按芍药苷峰计算应不低于
4、3000）以及水分、炽灼残渣，重金属等检测。2 赤芍饮片的质量检查2.1 性状: 本品应呈圆柱形，稍弯。表面棕褐色，粗糙，有纵沟和皱纹，并有须根痕和横长的皮乳样突起，有的外皮易脱落。质硬而脆，易折断，断面粉白色或粉红色，有的有裂隙。气微香，味微苦、酸涩。2.2 鉴别: 取本品粉末 0.5g，加乙醇 10ml，振摇 5 分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇 2ml 使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml 含 2mg 的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录B）试验，吸取上述两种溶液各 4l，分别点于同一硅胶 G 薄层板上，以三氯甲烷 -乙酸乙酯-甲醇-甲酸（ 40：5：10：
5、0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。2.3 含量测定：照高效液相色谱法（通则 0512）测定。2.3.1 色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.05mol/L 磷酸二氢钾溶液（40：65）为流动相；检测波长为 230nm。理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000。2.3.2 对照品溶液的制备取经五氧化二磷减压干燥器中干燥 36 小时的芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每 1ml 含 0.5mg 的溶液，即得。2.3.3 供试品溶液的制备取本品粗粉约 0.5
6、g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 25ml，称定重量，浸泡 4 小时，超声处理 20 分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。2.3.4 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10l，注入液相色谱仪，测定，即得。本品含芍药苷（C 23H28O11）不得少于 1.8%。3参考文献：2015 版中国药典3 赤芍总苷的提取工艺3.1 指标成分的选择及含量测定赤芍中所含丰富的苷类成分总称赤芍总苷，为赤芍的主要活性部位，其中以芍药苷的含量最高，选择芍药苷作为含量测定的指标成分。3.1.1 HPLC 色谱条件的优化选择色谱柱的选择：考察 Hypersil
7、ODS(150mm*4.6mm,5m)和 Hypersil BDS(200mm*4.6mm,5m)流动相选择：流动相考察甲醇-水系统、甲醇-0.05%磷酸溶液系统、乙腈-水及乙腈-0.05% 磷酸溶液系统。流速选择：流速考察 0.6ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min3.1.2 对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品 10.63mg，置 25ml 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液(每 lml 含芍药苷对照品 425.2g）。3.1.3 标准曲线的制备分别精密量取对照品贮备液溶液(425.2g/ml)0.5ml、l.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、
8、5.0ml 置 10ml 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取上述不同浓度对照品溶液各 10l 注入液相色谱仪，按前述色谱条件分别测定其峰面积。以对照品浓度 X 为横坐标，峰面积积分值 Y 为纵坐标，绘制标准曲线。3.1.4 供试品溶液的制备及测定取提取液，稀释至一定体积，滤过，即得供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10l，注入液相色谱仪，测定，由外标一点法计算即得芍药苷含量。3.2 提取溶媒的筛选：赤芍中所含苷类成分极性较大，在水、乙醇等亲水性溶剂中溶解度较好。本实验以芍药苷的含量为评价指标，考察水和不同浓度的乙醇对芍药苷的提取效率，筛选赤芍药材的最佳提取溶媒。见表 1
9、：4表 1 不同提取溶媒芍药苷含量提取溶媒 水 50%乙醇 70%乙醇溶媒用量( 倍) 6 6 6提取次数( 次) 2 2 2提取时间(h) 1.5 1.5 1.5芍药苷含量(%)3.3 正交试验设计优化提取工艺3.3.1 因素水平设置溶剂法提取中影响提取效率的因素主要有溶媒用量、提取时间及提取次数等。根据实际情况，设置醇用量、提取时间及提取次数为 3 个考察因素，因素水平设置见表 2。表 2 因素-水平表因素-水平 A 提取溶媒（倍） B 提取时间 （h） C 提取次数（次）1 4 1 12 6 1.5 23 8 2 33.3.2 实验安排及结果考察影响提取效能的主要因素乙醇用量、提取时间、
10、提取次数及相应水平，选取正交表 L9(34)作正交试验，所选因素一水平见表 2。称取川赤芍药材约50g，按 L9(34)正交试验表按排试验，以芍药苷含量(芍药苷含量=提取液中芍药苷质量/称取的药材量*100%)为评价指标。试验方案见表 35表 3 3L9(34)正交试验表3.3.3 验证试验以优化工艺条件重复试验 3 次，验证试验结果见表 4表 4 验证试验结果表头 A B C D 芍药苷含量（%）列号 1 2 3 41 1 1 1 12 1 2 2 23 1 3 3 34 2 1 2 35 2 2 3 16 2 3 1 27 3 1 3 28 3 2 1 39 3 3 2 1IIIIIISS
11、64 赤芍总苷（TPG）的纯化工艺的优化4.1 上样液预处理 赤芍醇提液减压浓缩至无醇味，加水适量分散溶解、过滤定容，制成每毫升含 0.2g 生药(0.2gml -1)的溶液，备用。4.2 大孔吸附树脂型号筛选 取 AB-8 型和 D-101 型大孔吸附树脂各 20ml，装于树脂柱中(径高比为 1:8)，取样液 40ml 上样。先用 3BV 蒸馏水，再用 5BV 20%乙醇洗脱，合并乙醇洗脱液，测定，结果见表 5。从芍药苷吸附解析率和残液中芍药苷含量综合考虑，选择树脂种类。表 5 树脂动态吸附实验结果树脂型号上样液含量(mg)吸附- 解吸率(%)残液中含量(%)D101 207.31AB-8
12、207.314.3 上样浓度考察取 AB- 8 型大孔吸附树脂 3 份，每份 20ml，装柱(径高比为 1:8)，分别取含生药浓度为 0.1g ml-1、0.2g ml -1、0.3gml -1 样品液上样，吸附流速为1.0mlmin-1。然后用 3BV 水洗脱，再以 5BV 20%乙醇洗脱，按 4.3 色谱条件进行测定醇洗脱液中芍药苷含量，结果见表 6。试验 试验号 投料量 固形物 固形物 RSD 芍药苷 芍药苷 RSD 方案 （kg） 得率 平均得率 含量 平均含量（%） （% ） （%） （%） （% ） （%）1237表 6 上样浓度考察结果上样浓度(gml -1)0.1 0.2 0.
13、3芍药苷洗脱量(mg)洗脱率(%)4.4 泄漏曲线考察 取 AB- 8 型大孔吸附树脂 20ml，装于树脂柱中(径高比 1:8)，取样品液 60ml上样，吸附流速为 1.0mlmin-1。收集流出液，每 5ml 为一流分。按如下色谱条件测定，绘制泄漏曲线，确定最大上样量。色谱条件：Diamonsil C18 色谱柱(250mm 4.6mm,5m)；乙腈为流动相 A，水为流动相 B，按表 7 进行梯度洗脱；流速 1.0mlmin-1；柱温 25；检测波长230nm。表 7 流动相梯度洗脱时间表时间/min 流动相 A/% 流动相 B/%0 14 8620 95 525 14 864.5 吸附流速
14、的考察 取 AB- 8 型大孔吸附树脂 3 份，每份 20ml，装柱(径高比为 1:8)，取样液60ml 上样，吸附流速分别为 1.0mlmin-1、2.0mlmin -1、3.0mlmin -1。进行动态吸附后，先用 3BV 水洗脱，再用 5BV 20%乙醇洗脱，按 4.3 色谱条件进行测定，结果见表 8表 8 吸附流速考察结果8吸附流速(mlmin -1)1 2 3芍药苷洗脱量(mg)洗脱率(%)4.6 树脂径高比考察 取直径依次为 1.4cm、1.5cm、1.6cm 的树脂柱 3 根，分别加入 AB- 8 型大孔吸附树脂各 20ml，装柱(径高比为 1:6、1:8、1:10) ，取样液
15、60ml 上样，吸附流速为 1.0mlmin-1。然后用 3BV 水洗脱，再以 5BV 20%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，按 4.3 色谱条件进行测定，结果见表 9。表 9 树脂径高比考察结果树脂径高比1:6 1:8 1:10芍药苷洗脱量(mg)洗脱率(%)4.7 水洗除杂体积考察 取 AB- 8 型大孔吸附树脂四份，每份 20ml，装柱(径高比 1:8)，取样品液60ml 上样，吸附流速分别为 1.0mlmin-1，进行动态吸附后，分别用1BV、 2BV、 3BV 和 4BV 水洗，测定水洗脱液中芍药苷的含量，计算损失率，结果见表 10。表 10 水洗除杂体积考察结果 水洗脱体积(BV)91
16、2 3 4水洗液中芍药苷累积含量(mg)芍药苷累积损失率(%)4.8 洗脱溶剂考察 取 AB- 8 型大孔吸附树脂 4 份，每份 20ml，装于树脂柱中 (径高比为 18)，60ml 样品液上样，吸附流速分别为 1.0mlmin-1。然后先以 3BV 水洗脱，再分别用 20%、40%、60%和 80%乙醇洗脱，按 4.3 色谱条件进行测定醇洗脱液中芍药苷含量，结果见表 11。表 11 洗脱溶剂考察结果洗脱剂乙醇(%)20 40 60 80芍药苷洗脱量(mg)洗脱率(%)4.9 洗脱曲线 取 AB- 8 型大孔吸附树脂 20ml，装于树脂柱中(径高比为 1:8)，60ml 样品液上样，吸附流速分
17、别为 1.0mlmin-1。然后先以 3BV 水洗脱，再用 20%乙醇洗脱，每 10ml 收集一份，洗脱液减压至干，以 10ml 甲醇复溶，按 4.3 色谱条件进行测定醇洗脱液中芍药苷含量，绘制洗脱曲线，确定洗脱剂用量。5 赤芍中赤芍苷提取物的质量控制5.1 性状：棕褐色粉末，气微香，味微苦、酸涩。5.2 鉴别：取本品粉末 0.2g，加乙醇 10ml，振摇 5 分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇 2ml 使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加乙醇制成每101ml 含 2mg 的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则 0502）试验，吸取上述两种溶液各 4l，分别点于同一硅胶 G 薄层板上
18、，以三氯甲烷 -乙酸乙酯-甲醇-甲酸（ 40：5：10：0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。5.3 含量测定：照高效液相色谱法（通则 0512）测定。5.3.1 色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.05mol/L 磷酸二氢钾溶液（40:65）为流动相；检测波长为 230nm。理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000。5.3.2 对照品溶液的制备取经五氧化二磷减压干燥器中干燥 36 小时的芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每 1ml 含 0.5mg 的溶液，即得。5.3.
19、3 供试品溶液的制备取本品粉末约 0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 25ml，称定重量，浸泡 4 小时，超声处理 20 分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。5.3.4 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10l，注入液相色谱仪，测定，即得。将提取物中芍药苷含量换算成药材中芍药苷含量，对比药典，检查提取纯化工艺是否合适。2015 版中国药典中规定赤芍药材中含芍药苷（C 23H28O11）不得少于1.8%。5.3.5 系统适用性试验线性关系考察 吸取上述对照品溶液 1.0ml、1.5ml 、2.0ml、2.5ml、3.0ml，分别置 25ml 量瓶内，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取 10l 注入液相色谱仪分析。以进样量（g）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，结果见表 12：
