1、酶联免疫检测技术简介万泰各项产品简介,李 一 然2008年4月,一、酶联免疫技术的基础及特点,什么是ELISA?,免疫测定（immunoassay，IA）是应用免疫学技术测定标本的方法。在临床检验中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗体或抗原性物质 。 ELISA是一种免疫测定。,基础定义,抗原（Antigen）：能在机体中引起特异性免疫应答的物质。抗体（Antibody）：能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。机体被微生物感染后，先产生IgM抗体，然后产生IgG抗体。
2、经过一段时间，IgM抗体量逐渐减少而消失，而IgG抗体可长期存在，在疾病痊愈后可持续数年之久。,重要指标,灵敏度：能检测到的分析物的最小量，表示检测下限的能力。特异性：鉴别阴性标本的能力。精密度：指对同一个标本进行重复分析，其结果间的符合率。,重要指标,稳定性：指在效期内试剂质量参数的变化。一般用非储存条件下较高温度进行破坏性实验数天，参观各质量参数的变化，一般37 1天相当于445天。质控血清：指为了对实验结果进行控制而配制的血清。一般用无溶血无脂血的血清或血浆。本底：指底色，如HbsAg ELISA试剂盒，阳性显色、阴性不显色，本底就是阴性显色的情况；,ELISA检测方法,1.夹心法. 2
3、.间接法. 3.竞争法. 4.捕获法.,夹心法,双抗原夹心：固相(包被)抗原Ag + 样品(抗体Ab) + 酶标抗原Ag* Ag-Ab-Ag* + 底物(TMB)显色双抗体夹心：固相(包被)抗体Ab + 样品(抗原Ag) + 酶标抗体Ab * Ab-Ag-Ab* + 底物(TMB)显色,间接法,固相(包被)抗原Ag + 样品(抗体Ab) + 酶标二抗Ab* Ag-Ab-抗Ab* + 底物(TMB)显色,竞争法,固相(包被)抗原Ag + 样品(无抗体Ab) + 酶标抗体Ab* Ag-Ab* + 底物(TMB)显色,捕获法,固相-抗IgM抗体(抗) + 样品(IgM) 抗-IgM + 酶标抗原Ag
4、* 抗-IgM-Ag* + 底物(TMB)显色,与其他检测方法比较,二、万泰各项产品简介,1、HIV,HIV ELSIA试剂的发展,简介,全称：人类免疫缺陷病毒HIV（1+2型）抗体诊断试剂盒方法：双抗原夹心酶联免疫法（第三代）检测对象：血液标本中的HIV总抗体原料：基因重组（万泰和厦大合作研制），包被GP41、GP120、GP36，片段齐全。检测窗口期：20天左右,优异的自产原料,1.大肠杆菌表达高活性、高特异性水溶性抗原；2.多表位表达蛋白抗原；3.相同表位的包被、标记抗原采用不同菌体表达，不同方法纯化；,基 因 重 组 多 表 位 嵌 合 抗 原,向其他试剂生产厂家提供原料,对HIV-2
5、型阳性出色的检测能力,试剂盒内设置有HIV 型和型阳性对 照，为国产试剂首创，我们使用美国BBI 血清盘Panel202对万泰试剂进行考核。,对HIV O亚型的检测,O亚型血来源于美国BBI,灵活、稳定的操作模式,实验温度可以设置在371。两步孵育时间均为302分钟。操作更灵活，试验更稳定，结果更可靠。,超强的抗干扰能力,临床研究显示，多种其他疾病潜在干扰因素血清标本均不会影响万泰两步法HIV诊断试剂盒的灵敏度和特异性，适合临床使用,众多的荣誉,第一个国产第三代HIV检测试剂,正在申报CE认证,2007年全年部分客户使用情况,29,首家推出第四代HIV试剂,HIV-Ab与HIV-Ag双系统检测
6、 HIV-Ag和HIV P24抗体共同包被 双抗原夹心法检测HIV-Ab 双抗体夹心法检测HIV-Ag生物素-亲和素反应系统应用 包被抗体生物素标记抗体HRP标记亲和素,30,临床考核,31,临床考核汇总,研究考核汇总： 进一步缩短窗口期，有效降低HIV传播风险 考核超过700份阳性标本（不同亚型和毒株），灵敏度100 保证高灵敏度的同时，具备优越的特异性 考核超过15000份阴性标本（包括特殊标本），特异性99.8,32,结 论 万泰 HIV Ag/Ab诊断试剂,全新第四代 HIV 筛查试剂为使用者提供 :,增强检验安全性,更可信赖的实验结果,33,我们在HIV方面的研发新进展,1、HIV确
7、证试剂（RIBA试剂） 与艾控中心，地坛医院等单位合作的十五攻关课题 目前已进行部分临床考核2、HIV唾液尿液检测试剂（DOT-ELISA） 与艾控中心，地坛医院等单位合作的十五攻关课题 目前已进行部分临床考核,2、乙肝两对半系列试剂,简介1,全称：1、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）诊断试剂盒2、乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）诊断试剂盒3、乙型肝炎病毒 E 抗原（HBeAg）诊断试剂盒4、乙型肝炎病毒 E 抗体（HBeAb）诊断试剂盒5、乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）诊断试剂盒,乙肝两对半检测原理,夹心法：阳性显色、阴性不显色（右）HBsAg、HBsAb、HBeAg竞争抑制法：阴性
8、显色、阳性不显色（左） HBeAb、HBcAb,简介3,潜伏期: 平均60-90 天 范围：45-180 天黄疸发生率: 5 岁, 10% 5 岁, 30%-50%急性病死率: 0.5%-1%慢性感染: 50次)发展中国家为主,占急性非甲非乙型肝炎 的3070%左右;临床表现类似甲肝，但不同的是：潜伏期更长, 40天 (1560天)；年龄较大；胆汁郁积更明显；病死率较高(15%)，孕妇(20%以上)；乙肝患者发生戊肝容易导致重症肝炎；二代病例罕见；无有效疫苗和治疗方法。戊肝是一种人兽共患病?!,基因分型 - 四型9群,戊型肝炎世界流行状况,戊肝广泛流行于世界各地，尤其是发展中国家。,Non-A
9、BC中25%是HEV引起的。,与人类密切接触的动物如猪、牛、羊、鼠、鸡、狗和野猴等体内陆续检出HEV抗体，以猪的感染率最高；猪、鼠体内分离的HEV与人HEV有很高的同源性；猪HEV和人HEV可成功感染猪、恒河猴和黑猩猩；以猪HEV感染过的猪肝、心、胰(静脉接种)和骨骼肌匀浆物、粪便(口服接种)再感染SPF猪，发现只有接种肝匀浆物的猪在3-7和14-20DPI出现抗体转阳和病毒血症。外环境中HEV RNA污染严重，如印度垃圾（11%）、西班牙垃圾（43.5%）、美国、法国。现有垃圾处理方法只对HAV有效，但对HEV效果不大。2003年Lancet： 3例食用被HEV RNA污染的鹿肉均发生急性戊
10、型肝炎；2003年 J Gen Virol: 日本在超市的猪肝中查到HEV RNA;印度（ 2003年8月）、江苏连云港（2003年5月）发生戊肝暴发。,戊肝是一种人兽共患病!,万例以上的戊肝暴发,戊型肝炎肆虐日本 感染者可能已达到650万人新华网东京2002年7月23日电(记者何德功) http:/ 一向被认为只在卫生条件恶劣的发展中国家流行的戊型肝炎如今在日本已经开始肆虐。日本国立感染研究所的全国调查表明，日本国民每20个人中可能就有1人感染戊型肝炎病毒，而全国戊型肝炎病毒感染者可能达到650万人。 日本国立感染研究所利用高精度抗体检查药物，抽样检查了1993年以后血库中保存的血清，其中日
11、本北部、中部和南部各300人。分析结果表明，共有49人的血清存在戊型肝炎抗 体，而且来自三个地区的人血清中都有感染者，这说明戊型肝炎感染范围涉及全国各地。其中，日本中部地区感染率最高，感染率占14.1%。 另据由全国21所国立医院、国立疗养所组成的肝病共同研究组调查表明，从1990年以后各医院诊断为原因不明的242位急性肝炎患者血清中，发现45人有戊型肝炎病毒，占18.6% 。 日本戊型肝炎感染途径也已初步查明。枥木县自治大学冈本宏明教授等人在本县20个养猪场抽样检查了86头猪的血液，其中在3个养猪场发现3头小猪有戊型肝炎病毒，因此初步断定日本戊型肝炎为“人畜共同感染症”。至于猪通过什么样的方
12、式把病毒传染给人，现在还在研究，有关专家估计，可能是由于猪的粪便污染饮用水和食物所致。 感染戊型肝炎病毒之后，由于身体抵抗力强，很多人没有明显症状，或只有轻微症状，但作为被感染的证据戊型肝炎抗体将终生留在体内，它可以起抑制戊型肝炎病毒增殖的作用，在戊型肝炎病毒感染者中这种隐型感染者占绝大部分。日本国立感染研究所提醒人们，戊型肝炎在日本已经大范围传染，只要有轻微症状，就要怀疑可能患有戊型肝炎，并立即采取适当治疗措施。,戊型肝炎中国流行状况,1982年即有报道；1986-88年间新疆南部大流行：发病12万例，死亡近千人。流行率为17.2%，并有10多次水/食物型暴发报道。国家八.五攻关课题：戊肝占
13、散发性急性肝炎的16.4%。回顾性调查上海市90年代早期1054例临床急性肝炎，戊肝占17.8%，占non-ABC肝炎的46.5%。2003年卫生部公布上半年传染病疫情表明：在7种肠道传染病中除戊肝报告病例同比增长43%外，其余均在下降；戊肝病死率在各型肝炎中最高，达0.39%。,2006年传染病发病增加率比较,数据来源于2006年卫生部公布的全国法定报告传染病疫情,在发病增加率上，戊型肝炎2006年比2005年同期增加40.4%，仅次于狂犬病和艾滋病，居肠道性传染病首位。,国内发生的戊肝暴发,HEV检测,戊型肝炎的特异性实验诊断方法,万泰公司HEV试剂：,HEV-IgM（捕获法）图解,TMB
14、+H2O2,样品,酶标抗原,包被抗IgM,TMB+H2O2,样品,酶标二抗,底物,包被抗原,HEV-IgG（间接法）图解,底物,戊肝试剂原理,两种抗原示意图,构象型抗原（WT）,线性表位抗原（GL）,构象型抗原能自发形成多种聚合体，类似于病毒颗粒的装配过程。 构象型抗原具有很强的构象依赖性表位，与HEV病毒颗粒表面的空间结构有较大相似性。 构象型抗原免疫的单抗能够直接捕获病毒，并具有中和活性。,E2抗原的发现及其特征,用大肠杆菌表达HEV结构蛋白ORF2的一个片段(E2)时发现，该蛋白可以自发形成二聚体，并且二聚体蛋白对戊肝恢复期血清有极强的反应性，这一反应性随着二聚体的解聚而消失 。,Wes
15、tern Blot,(See: J Med Virol, 2001,64:125-132),单体,二聚体,SDS-PAGE,恢复期血清,N,E2抗原对戊肝急性期血清和多年后的恢复期血清均有明显的反应，恢复期血清的反应性集中在二聚体上,二聚体,单体,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 N,急性期血清,E2抗原的发现及其特征,构象性表位,线性表位,4项国际国内专利,唯一有实验动物模型的肝炎试剂,不同戊肝试剂在急性戊肝中的灵敏度,与进口试剂的比较,See: Lin et al. J Clin Microbiol, 2000,38: 3915-39
16、18,GL IgG和GL IgM为新加坡一家公司的戊肝诊断试剂(间接法)GL IgG灵敏度和特异度均不理想，漏诊和假阳性明显；GL-IgM特异度尚佳，但灵敏度太差，漏诊严重。,不同戊肝试剂在其它肝炎中的特异度,小结,灵敏度：WT IgM（97.1%） GL IgG（93.8%）GL IgM（81.5%）；特异度：WT IgM（98.6%） GL IgM（96.7 %） GL IgG（85.4%）；在甲、乙和丙型肝炎中， WT IgM的特异度在97.6%以上；而GL IgM在甲型肝炎中的特异度仅为78.2%；综合评价认为：,6、胶体金系列,试纸条的结构及制造工艺,WT,1,2,3,4,5,6,7
17、,8,8,1. 塑料底衬2. 黏合剂3. 硝酸纤维素膜4. 对照线5. 检测线6. 交联垫（样品垫）7. 吸水纸8. 保护膜,试纸条图解,试纸条工作原理,在硝酸纤维素膜的检测线上包被有特异性抗体，对照线上包被有兔抗抗体，另一个特异性抗体在标记胶体金后干燥于硝酸纤维素膜下端的玻璃纤维上。 当样品由于层析原理流动时，首先溶解干燥的金标sAb单抗，特异性HBsAg抗原与其反应，在流过检测线时再和另一个单抗结合形成免疫复合物。由于包被单抗被固定在硝酸纤维素膜上，免疫复合物就被留下，逐渐形成肉眼可见的红紫色条带，此时该样品为阳性。继续流动到对照线时，金标sAb单抗和羊抗兔IgG结合显色，出现对照带。 当样品中不含HBsAg特异性抗原时，标记胶体金的单抗流过对照线时也可和该处的羊抗兔抗体结合也可形成红紫色条带，导致对照线显色。,WT,胶体金试纸条的优缺点： （1）优点:(a)灵敏度适中； (b)使用方便，适于快速诊断； (c)易于存放，效期长。 （2）缺点:(a) 应用时间短，范围小； (b)部分项目灵敏度较低； (c) 价格较贵。,万泰提供的胶体金系列,1、HBsAg2、HBV两对半3、HIV4、TP5、轮状病毒,94,谢谢！,
