1、抗 蛇 毒 血 清,抗蛇毒血清的研究现状,抗蛇毒血清的制备,抗蛇毒血清的作用原理,蛇毒种类,不同蛇毒致死量,中国十大毒蛇,抗蛇毒血清的定义,Thank you,中 国 十 大 毒 蛇,白 眉 蝮,灰蓝扁尾海蛇,尖 吻 蝮,金 环 蛇,眼镜王蛇,银 环 蛇,烙铁头,圆 斑 蝰,舟山眼镜蛇,白唇竹叶青,银环蛇1.0mg/kg 眼睛王蛇12mg/kg 平额海蛇3.5mg/kg 眼镜蛇15mg/kg 蝰蛇4.2mg/kg 蝮蛇25 mg/kg 金环蛇10mg/kg 竹叶青蛇100mg/kg,不 同 蛇 毒 致 死 量,蛇 毒 种 类,血液循环毒素 如蝰蛇、腹蛇、竹叶青、五步蛇等。它造成被咬伤处迅速肿胀
2、、发硬、流血不止，剧痛，皮肤呈紫黑色，常发生皮肤坏死，淋巴结肿大。经6-8小时可扩散到头部、颈部、四肢和腰背部。病犬战栗，体温升高，心动加快，呼吸困难，不能站立。鼻出血，尿血，抽搐。如果咬伤后4小时内未得到有效治疗则最后因心力衰竭或休克而死亡。神经毒素 包括金环蛇、银环蛇等蛇分泌的毒素。咬伤后，局部症状不明显 ，流血少，红肿热病轻微。但是伤后数小时内出现急剧的全身症状，病人兴奋不安，痛苦呻吟，全身肌肉颤抖，吐白沫，吞咽困难，呼吸困难，最后卧地不起，全身抽搐，呼吸肌麻痹而死亡。,混合毒素 眼镜蛇和眼镜王蛇的蛇毒属于混合毒素。局部伤口红肿，发热，有痛感，可能出现坏死。毒素被吸收后，全身症状严重而复
3、杂，既有神经症状，又有血循毒素造成的损害，最后，犬死于窒息或心动力衰竭。 细胞毒素 属眼镜蛇近亲的海蛇属于细胞毒素。海蛇毒液对人体损害的部位主要是随意肌，而不是神经系统。海蛇咬人无疼痛感，其毒性发作有一段潜伏期，被海蛇咬伤后30分钟甚至3小时内都没有明显中毒症状，然而这很危险，容易使人麻痹大意。实际上海蛇毒被人体吸收非常快，中毒后最先感到的是肌肉无力、酸痛，眼睑下垂，颌部强直，有点像破伤风的症状，同时心脏和肾脏也会受到严重损伤。被咬伤的人，可能在几小时至几天内死亡。多数海蛇是在受到骚扰时才伤人。,抗 蛇 毒 血 清 的 定 义,抗蛇毒血清是用蛇毒作为抗原 ,给实验动物反复进行注射免疫 ,一定时
4、间后使实验动物产生一定要求量的抗体,然后采血分离提纯而成 ,是专供治疗毒蛇咬伤的特异性生物制品 ,同时为蛇伤患者提供速效、高效、特效的药物。注射抗蛇毒血清使人体立即获得对相应蛇毒的抵抗力 ,以中和蛇毒的毒性作用 ,这就是蛇伤的人工被动免疫。,抗 蛇 毒 血 清 的 作 用 原 理,形成抗原抗体复合物，使蛇毒失去毒性作用抗蛇毒血清是以蛇毒作为抗原免疫动物，动物受抗原刺激后，产生一系列的免疫反应，抗原经巨噬细胞的各类酶的作用下，抗原决定蔟与巨噬细胞的mRNA结合，将抗原(蛇毒)信息传递给T细胞，由T细胞传给B细胞，B细胞受到刺激产生抗体。所以抗蛇毒血清利用该原理制备的抗体，能与该抗原(蛇毒)特异性
5、结合，,抗 毒 血 清 的 制 备,1、抗原制备 选择健康蛇取毒，新鲜毒液经20002500转离心处理15分钟左右，除去杂质，取上清经冻干成粉状备用。干燥之蛇毒需测定其毒力，应选择毒性强、抗原谱广(免疫电泳检验)的蛇毒作为抗原。,2、马匹免疫 将已除菌透析的蛇毒与配好的无菌油佐剂等量混合后用乳化器乳化,其抗原浓度分为0.12mg/ml和1mg/ml。 (1)前期免疫：马匹在进行蛇毒免疫前用浓缩破伤风类毒素进行两次前期免疫,以防止后期蛇毒免疫引起的破伤风。 (2)基础免疫：小剂量蛇毒抗原(每匹0.110.15mg)于马背部注射两针，每针间隔3周。 (3)超免疫：基础免疫后第2周测定马的血清效价,
6、当有明显抗体应答反应后进行超免疫,超免疫剂量从每匹马1mg分5-10次加大到10mg,每次免疫间隔2周,免疫部位为皮下和肌肉、穴位交替进行。,3、采血 试血效价按1mL免疫血清与不同稀释度的眼镜王蛇蛇毒溶液等体积混合,于37结合45min后接种小白鼠,雌雄各半,每个稀释度注射4只,记录72h小鼠死亡情况,以能保护小鼠全部存活的一组作为其试血效价。1mL免疫血浆能中和1mg蛇毒后，采血,离心分离血浆,保存于-20 ,累积几次血浆后,混合并制备。,4、抗蛇毒血清精制 (1)IgG提取：每100ml血浆磁力搅拌下加入固体硫酸铵,使硫酸铵终浓度为50%,搅拌30min后离心, 取沉淀,加入原血浆体积的
7、注射用水,搅拌至溶解, 加入固体硫酸铵,使硫酸铵终浓度为33%,搅拌至固体硫酸铵完全溶解后离心,取沉淀,沉淀加注射用水适量,搅拌至完全溶解、透析后离心,取上清即为IgG溶液。 (2)F(ab)2 制备：上述IgG溶液按0.111g/1000ml(原血浆体积)加入胃酶,6mol/L HCl调节pH=3.5，31酶解4-6h，5mol/L NaOH调节pH为5.2，置57保温30min，待温度降至45以下后,离心,上清为F(ab)2。,(3)F(ab)2纯化：上述F(ab)2用硫酸铵调节电导后上Pheny-l Sepharose(low-sub)柱,用112mol/L(NH4)2SO4+ 50mo
8、l/L磷酸钠缓冲液(pH=7.0)淋洗后,用注射用水梯度洗脱,分别收集各洗脱峰,并测定其F(ab)2纯度。 (4)抗血清效价测定：参照精制抗蛇毒血清制备及检定规程。 (5)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及分子量测定：电泳方法参照分子克隆实验指南。蛋白纯度用Bio-Rad Gel doc EQ 凝胶成像系统对电泳结果进行图像采集后, 使用Quantity One4.4凝胶分析软件得出。,抗 蛇 毒 血 清 的 研 究 现 状,自1896 年Calmet te首先研制成临床用的抗蛇毒血清, 并且奠定了抗蛇毒血清治疗蛇伤中毒的基础,迄今抗蛇毒血清的使用已有一百多年的历史,直至目前,国内外治疗蛇伤中毒,仍以抗蛇毒血清为首选的特效药物。我国抗蛇毒血清的精制方法2000版的中国生物制品规程采用的是胃酶消化-硫酸铵盐析的工艺,与以往的浓缩制品相比,由于采用了胃酶消化切割，收集的是有活性的分子量减小到原来一半左右的F(ab)2片段,从而降低了制品的过敏反应率。但目前采用的生产工艺仍存在一些问题,具体表现在：作为一个注射制剂纯度要求过低(60%)、收率也较低、无冻干工艺,使制品在保存运输上受一定限制。,
