1、1实 验 报 告课程名称： 生物化学实验（甲） 指导老师： 成绩：_实验名称： 蔗糖酶的提取及离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶 实验类型： 生化实验 同组学生姓名： 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得一、实验目的和要求1、学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法。2、学习离子交换层析的基本原理； 3、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术；4、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。 二、实验内容和原理1、酵母细胞破碎本实验
2、采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。2、蔗糖酶的初步分离纯化蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯。由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到较好地分离提纯效果。3、离子交换层析离子交换层析是常用的层析方法之一。它是以离子交换剂为固定相，根据流动相中的专业： 生物科学 姓名： 学号： 日期： 地点： 装 订 线2组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时
3、的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换剂与流动相中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。在某一 pH 值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的 pH 改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。4、酶活力检测(定性检测）蔗糖酶是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的 1,2糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。因此，每水解 1mol 蔗糖
4、，就能生成 2mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法，如采用 3.5二硝基水杨酸法，其原理是 3.5二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。本实验在离子交换层析分离纯化的过程中，对分离纯化样品采用 3.5二硝基水杨酸法来初步判定样品中还原糖含量的多少，由此来确定并收集蔗糖酶纯化样品。三、实验材料与试剂1、实验材料市售干酵母粉 10g/组，蔗糖酶粗分离纯化样品 2、实验试剂1、石英砂；2、95% 乙醇(-20 ）；3、DEAE-Sepharose Fast Flow (弱碱性阴离子交换剂 )；4、20mmol/L Tris-HCl pH
5、7.3 缓冲液；35、20mmol/L Tris-HCl，（1mol/L NaCl） pH7.3 缓冲液；6、0.2mol/L 乙酸缓冲液，pH4.5 ；7、5% 蔗糖溶液 ；8、3，5- 二硝基水杨酸试剂四、实验器材与仪器1、电子天平（称量样品）；2、研砵（每组一套）；3、50ml 高速离心管（4 支/组、4 孔 50ml 离心管架一个 /组）；4、托盘天平（离心管平衡用）；5、高速冷冻离心机；6、恒温水浴箱；7、制冰机；8、1.5ml 离心管；9、20冰箱；10、层析柱（1.020 ）(1 支/组）；11、恒流泵（流速 0.81ml/min）(10rpm)（1 台/组）；12、梯度混合器(
6、100ml 梯度杯)（1 套/组）；13、核酸蛋白检测仪（灵敏度 0.5A）（1 台/组） ；14、记录仪（纸速：0.5mm/min；灵敏度：50mV）（ 1 台/ 组） ；15、部分收集器及收集试管（1 台/组） ；16、铁架台、夹子 （固定层析柱用）（1 套/组） ；417、20冰箱；18、试管、试管架等。五、操作方法和实验步骤1、酵母细胞破碎称取市售干酵母粉 10g，约 3-5 g 石英砂放入研钵中直接干燥充分研磨至尽可能成细粉末状（约 15 分钟），量取总体积 30-40 ml 的 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液，分2 次加在研砵内研磨 10 分钟，使呈糊状液体
7、（研磨越彻底，释放出的蔗糖酶越多）；将糊状液体转移到 2 支 50ml 离心管中，两支离心管平衡后，4、12000r/min 离心 15 分钟（这次离心分离掉酵母碎片和酵母），收集上清液并量出体积 V1（样品 I）,另留 1ml 上清液（样品 I ）放置20冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE 分析。2、热处理：将上一步抽提液（样品 I），迅速放入 50恒温水浴中，保温 30 分钟，并用玻璃棒温和搅拌抽提液（由于蔗糖酶相对耐热，热处理能除去很多不耐热的杂蛋白），保温后迅速用冰浴冷却 5 分钟，转移至两支 50ml 离心管中，平衡后， 4，15000r/min 离心
8、 15分钟（由于离心过程会产生热量，故保持 4一方面保证样品不被破坏，另一方面保护离心机不因过热而损坏），收集上清液并量出上清液体积 V2（样品），另留 1ml 上清液（样品）放置20冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶活力和 SDS-PAGE 分析。3、有机溶剂（乙醇）沉淀：将热处理后的上清液逐滴加入相同体积的20的 95%乙醇（酒精除去水膜令蛋白5沉淀，但由于乙醇会使蛋白局部变形且在 4以上时可使大部分蛋白完全变性，故保持4以下减少变性造成的损失），冰浴中温和搅动混匀，至少放置 20 分钟，然后转移至两支 50ml 离心管中，两支离心管平衡后，4，12000r/min 离心 10
9、分钟，弃去上清液，沉淀放置20冰箱保存。4、离子交换剂准备：(实验室已准备好） 5、样品处理：将乙醇沉淀的蔗糖酶蛋白样品充分溶解于 15ml 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液；4 15000r/min, 离心 10 分钟，收集样品上清液（样品）测量总体积(ml 数），取 4ml进行分离，其余置于 5ml 离心管中并放入20冰箱。6、纯化检测仪器连接：将梯度混合器(100ml 梯度杯)，层析柱（1.020 ），恒流泵 (10rpm) （流速0.81ml/min），核酸蛋白检测仪（灵敏度 0.5A），记录仪（纸速：0.5mm/min，50mV）、部分收集器（45 ml/管/5
10、min）等连接并设置好。7、装柱(层析柱规格 120cm)、平衡 ： 装柱前先调好流速 5ml/10min ，然后将柱下端的出水口关闭，加进 5ml（约 1/3 柱床体积） 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3 的缓冲液，然后将处理好的 DEAESepharose Fast Flow，轻轻搅匀（注意不能太稀，也不能太稠，刚好呈流质状态）沿玻棒靠近柱管壁慢慢连续加进柱内至层析柱上端。注意不能带进气泡，待凝胶自然沉积离柱管上端约 1-2cm后松开层析柱出口，控制流速 5ml/10min；待柱内 DEAE Sepharose Fast Flow 凝胶沉降至稳定高度并分出水层后，吸去水层，
11、用玻棒将沉降界面搅匀，再补加处理好的 DEAESepharose Fast Flow 凝胶，直到凝胶沉降至稳定高度距层析柱上端约 3cm 处为止（这时须保持 DEAESepharose Fast Flow 凝胶柱面平整）。用 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3 的缓冲6液连通层析柱，进行柱平衡，直到流出液与缓冲液的 pH 一致。8、加样：停止加入 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。待缓冲液液面与胶体表面相切时，恒流泵停止工作。用胶头滴管缓慢将蔗糖酶蛋白样品溶液（样品）加入层析柱中，注意顺着柱壁滴加，尽可能保持胶面平整。打开恒流泵，使样品溶液进入胶体，待样品溶
12、液完全进入胶体后，用少量洗脱缓冲液将残余在层析柱壁上端的样品洗下，并完全进入胶体后，再加洗脱缓冲液至一定高度。9、洗脱：梯度洗脱法： 加样后，用 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液进行平衡，洗脱流速为 5ml/10min ，洗去未被 DEAE Sepharose Fast Flow 凝胶吸附的杂蛋白，待层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上绘出的基线稳定，用 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液 NaCl 梯度洗脱（浓度为 0-1mol/L NaCl ），层析柱联上梯度混合器，混合器中分别为 50ml 0.05mol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液和 5
13、0ml 含 1mol/L NaCl 的 0.05ml/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。洗脱流速为5ml/10min ，每 5ml 接一管，洗脱至缓冲溶液流完为止。将蔗糖酶活力高的若干管酶液集中，测量总体积（ml 数）（样品），样品20低温保存备用。10、蔗糖酶活力检测：收集活力高的蔗糖酶液，测总体积(ml 数) （样品），-20保存空白对照 样品管0.2mol/L 乙酸缓冲液，pH4.5 1.5ml 1.4ml5%蔗糖溶液 0.5ml 0.5ml蒸馏水 1.0ml 0.9ml分离纯化样品溶液 / 0.1ml50水浴 8min 73.5二硝基水杨酸试剂 1.0ml 1.0ml100水浴
14、 5min 观察颜色六、实验数据记录和处理1.、V1=22.5ml ，V2=18.5ml，V3=6.5ml，2、核酸蛋白检测仪波形图其中，从左至右第一个峰并未检测出蔗糖酶，第二个大峰所在处收集的溶液检测出蔗糖酶，故收集第二个大峰对应的试管里面的液体。七、实验结果与分析由图 1、图 2 曲线的不同分布可以看出：当蛋白质含量最高时，蔗糖酶的含量并非最8高。这说明在样品中存在其他蛋白质类的杂质。试管号为 7、8、9（即 F4-7、F4-8、 F4-9）对应的样品中蔗糖酶的含量相对较高，可知需保存这三管试样进行之后的实验。八、讨论、心得1、实验操作过程中应小心注意，切勿打翻样品液；2、装柱时应小心不带入气泡，否则需重新装柱；3、层析时应控制液体流速，以免过快导致所得样品液杂蛋白含量过高。
