1、1,鼠单抗的改造,2,本章主要内容,概述C区的人源化-嵌合抗体V区的人源化-改型抗体小分子抗体,3,概述,鼠源性单抗在临床应用中存在的问题具免疫原性 激发免疫应答，消弱疗效，产生副作用与FC片段相关的功能不能有效活化 如活化补体，ADCC,调理作用半衰期短,4,概述,鼠源性单抗的改造原则保持原来抗体的特异性与亲和力；尽量减小其免疫原性。发展阶段C区的人源化-嵌合抗体 鼠抗V区与人抗C区组装而成V区的人源化 改型抗体小分子抗体,5,C区的人源化-嵌合抗体,1984 Morrison首次报道依据 90%的人抗鼠抗体反应针对鼠抗C区基本手段从杂交瘤中获得鼠抗V区基因从人B细胞获得人抗C区基因将二者克
2、隆到表达载体转染哺乳动物细胞，进行表达,6,C区的人源化-嵌合抗体,主要形式嵌合IgG嵌合Fab嵌合F(ab)2,7,C区的人源化-嵌合抗体,嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgG 如何构建？,8,C区的人源化-嵌合抗体,嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgG抗体基因的克隆鼠抗V区基因的获得 RT-PCR方法 引物设计：依据VH和VL的组成-由4个相对保守的FR和3个CDR，设计（注意酶切位点）。,9,C区的人源化-嵌合抗体,嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgG抗体基因的克隆鼠抗V区基因的获得 提取mRNA：从杂交瘤或脾细胞中获得 RT-PCR法克隆
3、VH和VL基因,10,C区的人源化-嵌合抗体,嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgG抗体基因的克隆人抗C区基因的获得 C区的选择：依据目的不同选择C区即抗体亚型，如补体活化能力， ADCC等 IgG1的补体活化及ADCC作用强于 IgG3，而IgG4没有或很弱。 与Fc受体结合力IgG1和IgG3 最强 IgG1和 IgG4半衰期较长,11,C区的人源化-嵌合抗体,嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgG抗体基因的克隆人抗C区基因的获得 引物设计：C区基因，设计时注意酶切位点 提取mRNA：从B细胞中获得 RT-PCR法克隆C区基因,12,C区的人源化-嵌合抗体,嵌合
4、IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgG表达载体的构建 构建嵌合L链与H链的重组质粒 注意必须是真核表达载体,13,C区的人源化-嵌合抗体,嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgG嵌合抗体的表达 转染哺乳动物细胞进行表达 哺乳动物细胞的选择：骨髓瘤细胞，COS细胞，CHO细胞等。,14,几种常用宿主细胞的表达特点,COS细胞 短暂表达较为理想，几天内即可装配成功骨髓瘤细胞 最主要的宿主细胞，如NS0CHO细胞 常用宿主细胞，300-900mg/L,15,嵌合IgG优点与不足,优点保留了鼠抗的特异性与亲和力基本解决鼠抗免疫原性所致的不良反应能有效激活补体及ADCC延长半衰期改
5、善药代动力学特性,16,已批准上市的治疗性单抗,2001,淋巴瘤,CD52,人源化抗体,Campath,2000,淋巴瘤,CD33,人源化抗体,Mylotarg,1998,RSV感染,RSV F蛋白,人源化抗体,Synagis,1998,乳腺癌,HER-2,人源化抗体,Herceptin,19981999,炎症性肠病类风湿关节炎,TNF-,人-鼠嵌合抗体,Remicade,1998,移植排斥,CD25,人-鼠嵌合抗体,Simulect,1997,淋巴瘤,CD20,人-鼠嵌合抗体,Rituxan,1997,移植排斥,CD25,人源化抗体,Zenapax,1994,冠心病,血小板,人-鼠嵌合Fab
6、,ReoPr o,1995,大肠癌,17-1A,鼠单抗,Panorex,1986,移植排斥,CD3,鼠单抗,OKT3,批准日期,适应症,靶向抗原,抗体种类,抗体名称,17,嵌合IgG优点与不足,不足仍具一定抗原性分子量较大，组织穿透能力较差清除较慢 在导向诊断与治疗方面受限,18,C区的人源化-嵌合抗体,Fab和F(ab)2嵌合抗体Fab克隆鼠抗V区基因克隆人抗CH1和C基因重组构建表达载体转染宿主细胞，表达嵌合抗体,19,20,C区的人源化-嵌合抗体,Fab和F(ab)2嵌合抗体F(ab)2化学偶联法 通过化学试剂将Fab连接成一个双价抗体分子重组末端修饰法 在Fab的C端额外连接一个Cys
7、残基：效率较低 连接（CPP）3，效率可达70%,21,C区的人源化-嵌合抗体,Fab和F(ab)2嵌合抗体优点可原核表达 包涵体 ：高效，可达30%，复性难 分泌表达：周质腔，可溶有活性，避免降解，降低毒性 成功范例：抗CD3的Fab 700mg/L 人源化抗体HuMab4125-8 Fab 2g/L,22,C区的人源化-嵌合抗体,Fab和F(ab)2嵌合抗体优点可原核表达良好的药物载体血液清除率高导向诊断与治疗,23,C区的人源化-嵌合抗体,Fab和F(ab)2嵌合抗体缺点无ADCC,CDC滞留时间短仍具一定抗原性,24,V区的人源化,嵌合抗体不能完全解决抗原性问题 V区的人源化将鼠抗CD
8、R移植到人抗V区中的FR区。构建策略CDR移植抗体 最为普遍CDR序列组成及构象分析,确定策略人源FR模板的重构,25,V区的人源化,构建策略CDR移植的人源化抗体移植策略完全CDR移植 将鼠抗全部6个CDR，克隆到人抗相应FR区上,26,V区的人源化,构建策略CDR移植的人源化抗体移植策略部分CDR移植 外源性CDR仍具潜在抗原性 研究表明，轻链的CDR1,CDR2和重链CDR3是维持抗原结合所必需。 将必需CDR移植到人抗FR上，得到人源化抗体,27,V区的人源化,构建策略CDR移植的人源化抗体移植策略SDR转移 研究发现，CDR中的只有特定区域（SDR）参与了表位的识别和结合。 SDR包
9、括暴露在外与表位结合的残基，维持V区构象的残基。 将SDR移植到人抗相应位置上，得到人源化抗体,28,V区的人源化,构建策略CDR移植的人源化抗体人源FR模板的重构 原则：鼠CDR能正确折叠，保持原来构象 包括：从同源抗体或抗体共同序列中选择人源FR；根据已知信息，确定FR中起关键作用的氨基酸,29,V区的人源化,构建策略CDR移植的人源化抗体人源FR模板的重构鼠源FR替换模板的选择 采用统一的人源FR作为替换模板：一般选择人抗最常见的VHIII和VI的框架区作替换模板。 好处：模板信息明确，避免盲目 不足：不易保持鼠抗CDR的天然构象，可能降低或丧失亲和力。,30,V区的人源化,构建策略CD
10、R移植的人源化抗体人源FR模板的重构鼠源FR替换模板的选择 在抗体序列库中搜寻与鼠抗FR最大同源性的人源FR作为替换模板 好处：减少需要更改的氨基酸数目，更好保持CDR需要的空间环境。,31,V区的人源化,构建策略CDR移植的人源化抗体人源FR模板的重构人FR模板的残基变换 FR残基对表位结合也有影响 FR为CDR形成正确构象提供平台 因此，在替换时尽量保留与CDR有相互作用，或与抗体亲和力密切相关，或对FR空间结构起关键作用的残基。,32,V区的人源化,构建策略CDR移植的人源化抗体人源FR模板的重构人FR模板的残基变换 如何确定这些残基？ 规范结构法、分子模拟，随即突变，序列分析，抗体库技
11、术等，需晶体数据和三维结构分析数据。,33,V区的人源化,构建策略鼠抗V区的表面重塑 对鼠CDR及FR表面残基进行修饰或重塑，使其类似于人抗CDR轮廓或人FR式样。前提：鼠抗V区抗原性源于表面残基研究表明，表面残基携带绝大部分表位。表面形式的差异是人鼠抗体间的主要差别。将鼠源性残基替换成人源的，模拟人抗的表面轮廓，逃避人免疫攻击。,34,V区的人源化,构建策略鼠抗V区的表面重塑 对鼠CDR及FR表面残基进行修饰或重塑，使其类似于人抗CDR轮廓或人FR式样。好处：改变的残基少，可减少CDR与FR间的不相容性。正在完善之中争论热点：鼠抗引起的人抗鼠抗体反应是由表面残基还是由内部残基引起？,35,V
12、区的人源化,构建策略表位导向的人源化抗体 利用表位导向选择进行鼠抗人源化要点：首先保留鼠抗H或L链； 特定抗原体外筛选它与人抗L或H链组合成的杂合抗体，找出维持其活性的人抗L或H链； 利用筛出的人抗L或H链，再筛出人抗H或L链，二者组合成完全人源抗体。基础：建立完整的人抗体库 正在探索，前景广阔,36,V区的人源化,技术方案鼠抗V区基因的获得PCR法筛选阳性克隆设计 鼠抗氨基酸序列分析：判断CDR区，特殊FR残基，糖基化位点，其它重要残基,37,V区的人源化,技术方案设计 鼠抗氨基酸序列分析 鼠抗V区空间结构的模拟 人抗FR区序列的选择： 固定或同源匹配的FR区 L/H FR来源相同还是不同
13、选择人亚群一致还是特殊FR 确定选择人FR方案 抗体亚类的考虑,38,V区的人源化,技术方案设计 鼠抗氨基酸序列分析 鼠抗V区空间结构的模拟 人抗FR区序列的选择 鉴别所选FR中公认的比较重要的回复突变 供体和受体序列分析 重新确认FR序列的选择并设计人源化抗体序列,39,小分子抗体,克隆鼠抗V区基因，连接而成的抗体,40,小分子抗体,克隆鼠抗V区基因，连接而成的抗体单链抗体Single Chain Fv ScFv 由抗体VH、VL基因通过一段连接肽基因拼接后，表达形成的重组蛋白。 具有抗原结合能力的最小抗体片段，可在一些不需Fc段效应功能的实际应用中开展研究和应用。,41,小分子抗体,克隆鼠
14、抗V区基因，连接而成的抗体单链抗体Single Chain Fv ScFv基本环节从杂交瘤或脾细胞中提取mRNART-PCR法获得VH和VL基因 设计linker,将其连接在一起克隆到表达载体基因表达,42,小分子抗体,克隆鼠抗V区基因，连接而成的抗体单链抗体ScFv方法要领原则 保持抗体分子的可溶性 设计理想的linker序列linker序列设计的要点 长度与性质不应干扰V区的折叠，不干扰对抗原的结合,43,小分子抗体,克隆鼠抗V区基因，连接而成的抗体单链抗体ScFv方法要领原则linker序列设计的要点 长度： 不应过短或过长，一般15AA，如 (Gly4Ser)3,44,小分子抗体,克隆
15、鼠抗V区基因，连接而成的抗体单链抗体ScFv方法要领原则linker序列设计的要点 不干扰功能区折叠：残基侧链选择，不宜过 大，如Gly,Ser 亲水性大小，如Thu,45,小分子抗体,克隆鼠抗V区基因，连接而成的抗体单链抗体ScFv优点 分子量小,易于穿透组织到达靶器官 易于构建和生产不足 易于被清除,46,小分子抗体,克隆鼠抗V区基因，连接而成的抗体双链抗体dsFv 在VH和VL适当部位各引入1个Cys，形成二硫键 结合能力和稳定性均优于ScFv 组织穿透和血清清除率平衡,47,小分子抗体,克隆鼠抗V区基因，连接而成的抗体双价小抗体diabody 缩短linker，使两分子ScFv形成双价小分子抗体 结合性能优于单价分子,48,小分子抗体,克隆鼠抗V区基因，连接而成的抗体迷你抗体minibody 将人的CH3连在ScFv羧基端，形成迷你抗体 半衰期较长，组织穿透和血清清除率平衡 免疫治疗最具潜力载体,49,小结,50,本章鼠源单抗的改造，皆是建立在免疫动物基础之上的。杂交瘤细胞中，抗体已经选择与亲和成熟，mRNA丰度高，所得抗体亲和力及阳性率高,但只能制备单一特异性抗体,
