1、止血与凝血障碍检验,上海交通大学医学院胡翊群 教授,血栓与止血（thrombosis and hemostasis） 涉及血管壁、血小板、血液凝固、抗血液凝固、纤溶系统和血液流变学等基础理论，也涉及上述各方面相应的实验检查，为研究和诊断出血性疾病和血栓性疾病所必需。本讲就血栓与止血的基础理论、实验室检查和临床诊断作一简述。,基本理论（1）,出血的概念（BLEEDING）血栓的概念（THROMBOSE）出血性疾病（BLEEDING DISORDER，HEMOPHILIA）血栓性疾病（THROMBOTIC DISORDER）易栓症（THROMBOPHILIA）高凝状态（HYPERCOAGULABL
2、E STATE）低凝状态（HYPOCOAGULABLE STATE）,Bleeding: 血液从血管内外流至组织间隙、体腔或体表的现象。Thrombose: 在活体的心脏或血管内，流动着的血液发生凝固或血液中某些成分析出凝集形成的固体快。Bleeding disorder: 人体的正常止血功能发生障碍，发生自发性出血或损伤后出血不止的疾病的总称。,Thrombotic disorder: 因动脉、静脉或微循环血栓形成所引起的一类疾病。Hypercoagulable state: 血液比正常易于发生凝固的状态， 即血液凝固性增高。Hypocoagulable state: 由于抗凝因素增加，血液
3、呈现不易凝集的状态。多见于DIC的高凝期之后，由于coagulable factors 和 platelet的大量消耗，特别是PLT,II, V, VIII, X, XII 等因子及血小板明显降低，形成了所谓消耗性凝血障碍，出现广泛性出血。,基本理论（2）,血栓止血理论的适用范围 小血管和微血管大血管与粥样硬化的问题血液流变学问题,Capillaries are made only of endothelium,基本理论（3）,参与血栓的因素 有形成分：血小板、红细胞、中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、内皮细胞 无形成分：凝血因子（蛋白）、血液凝固调节蛋白、细胞因子（炎性因子，趋化因子，黏附分子
4、等） 血流,Endothelium,Organisms,The Role of Activated Protein Cin Severe Sepsis,Laboratory Investigation of Hemostasis,一百年前确定的Virchows血栓模式,导致血栓的各种因素,血管壁受损,血流改变（主要是血流缓慢、涡流）,血液凝固异常,Types of Mucocutaneous hemorrhage,Petechia(出血点;瘀点): pinpoint hemorrhage 3- 5mm in diameter Ecchymosis(瘀斑): common bruise, 5mm
5、Hematoma(血肿): local elevation and fluctuationEpistaxis(鼻出血)Bleeding in skin, mucous membrane, joint cavity and viscera(内脏).,血管的血栓止血检查,血管基本上是一个密闭的管道系统。以保证血液有序地在其中不停顿、不外溢地流动。这种管道是由连续的管壁所围绕而成的，要保证血管的正常作用就必须是一个具有完整管壁结构不至于发生血液外渗；又具良好管壁顺应性和光滑平整的内侧面，并有释放活性物质的功能，而不至于血液流动受阻，甚至中止。这就涉及血管壁的结构以及相关的止血作用。,一、血管壁的结构
6、,血管壁的结构大致可分为三层：最内侧与血液接触的内膜层，中间具有保持血管形状、弹性和伸缩作用的中膜层，最外侧由结缔组织来分隔血管壁与机体、其他组织的外膜层。所有血管都有内膜层和外膜层。但外膜层因血管的大小而厚薄不等；中膜层则毛细血管完全缺如，小血管较薄，大血管或动脉血管较厚。,（一）大血管的基本结构,传统上把直径大于100m的血管称为大血管。在血栓止血机制中，大血管的作用并不明显，但大血管管壁的三层结构界定清楚，并有着与其他血管不同的特殊结构。 1内膜 大血管的内膜(intima) 由内皮层(endothelium) 和内皮下组织(subendothelium)组成。在大血管内皮细胞具有特异性
7、结构的成分是，胞质中都包含一个Weibel -Palade小体。小体的内容物是von Willebrand因子（也叫血管性血友病因子，vWF），外裹的膜上表达了P选择素（P-selectin）。生理情况下，内皮细胞紧密排列在基底膜上，内皮细胞和基底膜共同构建起了双重防止血液外渗的屏障。内皮下组织则由少量平滑肌细胞和零散的巨噬细胞及其中填充的细胞外间质所组成的内皮下基质所构成。,2中膜 大血管的中膜（media）是较厚的一层。往往由一层基本的弹性蛋白质（elastic lamina）来隔离内膜，并最大限度地保持血管壁的形状和维持血管壁的质地。中膜层还具有相当数量的平滑肌细胞及其分泌的糖蛋白(gl
8、ycoprotein)和蛋白聚糖(proteoglycans)。3外膜 处在中膜外的一层疏松结缔组织被称为外膜（advertitia）。外膜中有些神经末梢和滋养血管，其主要作用是完整地、连续地将血管与周围组织器官分隔开。,（二）小血管结构,小血管是参与止血作用的主要血管。其中的小动脉、小静脉与大血管的结构基本相同，只是中膜略薄。最具特殊性的是毛细血管（capillary）和后毛细血管（post- capillary venule）的管壁，是仅有内皮细胞和间质细胞组成的单层细胞结构所围成。这两种细胞根植于基底膜，依赖血管床而排列，细胞间存在大量基质，基质中的不少蛋白都由内皮细胞和间质细胞分泌而来
9、。两种细胞可借助细胞旁小孔完成必要的联系。如果说小血管与大血管的内皮细胞具有类似的作用，那么长型的间质细胞却有着不同的功能。对间质细胞功能比较一致的看法是：具有收缩功能以调节进入组织的血流量；调节毛细血管的生长机制；具有促进脂肪细胞、巨噬细胞、成骨细胞和平滑肌细胞分化的潜能。,二血管的止血作用,血管的止血作用主要是与血液流动密切相关的内膜层的止血作用，血管与血小板共同构成止血所需初级血栓，完成机体的一期止血。而内膜的主要成分是血管内皮细胞。在此，以内皮细胞为例来阐明血管的止血作用。,（一）内皮的止血作用,血管内皮止血作用主要表现在两个方面：参与小血管的收缩；内皮细胞表面表达的活性物质和分泌释放
10、入血的活性成分参与对血小板、血液凝固和血液凝固的调节作用。,1收缩作用 血管收缩是血管参与止血最快速的反应。可直接引起血流减慢、血管损伤处的闭合、血管断端的回缩，以及出血的终止。这种反应，最快时仅需0.2秒左右。对大血管而言，血管收缩通常是中膜层平滑肌细胞在神经调节下完成的，这种血管收缩不至于导致血管闭合，只会影响血流；小血管收缩，则依赖于内膜层中的周皮细胞，这种收缩是强烈的，主要依赖体液中的活性物质，发生持续的收缩反应，在血栓止血中具有重要作用。,2激活血小板作用 内皮细胞在补体、纤维蛋白、葡萄糖，甚至某些药物，如1-去氨基-8-D-精氨酸加压素（DDAVP）的作用下可增加vWF的合成和释放
11、，进而激活血小板，使血小板通过vWF粘附在内皮细胞表面。胶原、凝血酶、肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor, TNF）等均可促使内皮细胞释放血小板活化因子（platelet activating factor, PAF），而PAF是迄今已知最强的血小板诱聚剂，可诱导血小板活化、聚集。当血中PAF浓度达到相当高的时候，可直接引发血栓形成。,3促进血液凝固作用 人类已知的14个凝血因子中有9个存在于内皮细胞中，当内皮细胞破损时，组织因子(tissue factor, TF)、因子V和纤维蛋白原(fibrinogen, Fg)可进入血液，在局部引起快速的凝血激活和纤维蛋白形成。
12、另外，在细胞因子和其他尚不明确的因素作用下，内皮细胞可表达因子IX、因子X，促进血液凝固。而内皮细胞参与合成和释放的因子XII，无论是否已被活化，都已证实与因子XI或因子IX以及高相对分子质量激肽原一样不参与体内的凝血过程。内皮细胞中的Ca2+，可自由进出内皮细胞膜内外，对调节血液凝固速度有着重要作用。,4血液凝固的调节作用 内皮细胞受损时，由它合成和分泌入血的纤溶酶原活化抑制剂(plasminogen activator inhibitor, PAI)特别多，远大于组织纤溶酶原活化物(tissue plasminogen activator ,t-PA)的合成和释放。PAI活性的增高，显然在
13、血液凝固调节中起到阻止血液凝块溶解的作用，可以加强止血作用。在内毒素、凝血酶、TNF和IL-1的刺激下，内皮细胞都能合成PAI。缺氧时，又能促使内皮细胞释放PAI。,（二）内皮细胞的抗血栓形成作用,1血管松弛和舒张作用 前列环素（prostacyclin ,PGI2）和一氧化氮（NO）是内皮细胞直接产生的两种血管松弛舒张物质，可有效防止因小血管的持续收缩导致的血栓形成。NO可使平滑肌细胞内cGMP水平升高，使平滑肌松弛。另外，NO还能抑制ADP等对血小板的诱聚作用，以及减少血小板内Ca2+而直接抑制血小板聚集。,2抑制血小板聚集的作用 上述NO有血小板聚集抑制作用，PGI2在扩张血管的同时，也
14、有血小板聚集抑制作用，只不过PGI2的一个较稳定代谢产物6-酮-PGF1和这两者稳定的代谢产物6-酮-PGE1也有抑制血小板聚集作用，但血中6-酮-PGE1的量很低。内皮细胞还具备亚油酸中成分13-羟-十八碳-二烯酸(13-hydroxyoctadecadienoic acid, 13-HODE),能较强地抑制血小板粘附和聚集，并对抗血栓烷A2的作用。但13-HODE的合成和释放可被凝血酶、胰蛋白酶所抑制。,3血液凝固和调节作用 血管内皮细胞是抗凝血酶(antithrombin, AT)、蛋白C系统的血栓调节蛋白(thrombomodulin, TM)、组织因子途径抑制物（tissue fac
15、tor pathway inhibitor,TFPI）和t-PA合成和释放的主要场所。这些产物可直接或间接地通过灭活凝血活化因子、促进血块溶解、抑制血小板活化等途径来对抗血栓形成。,（三）血管内皮的异质性,不同组织中的血管内皮细胞存在着很多不同的特性，有的很活跃(activity)，有的很安静（quiescent）；有的呈扁平状，有的较肿胀；还有的具有高生物合成能力。现在把内皮细胞的这种特点，称之谓异质性(endothelial heterogeneity)。有一些内皮细胞比较活跃，可能在血栓止血功能中扮演更加重要的角色。由于此类内皮细胞较肿胀，主要集中在后毛细血管内膜中，被称为高内皮细胞微静
16、脉(high endothelial venule, HEV)。HEV的内皮细胞具有高生物合成能力。在缺氧、高血糖、细胞因子等作用下，可合成分泌各型胶原(collagen)，在很晚抗原-2(very late antigen -2,VLA-2)的协同下，刺激内皮细胞增殖；还可合成分泌纤维连接蛋白(fibronectin, Fn)、玻璃连接蛋白(vesonectin, Vn)和凝血酶敏感蛋白(thrombin sensitive protein, thrombospondin，TSP)，他们都参与血小板糖蛋白IIb/IIIa或Ic/IIa或IIIb的结合，在血小板粘附于内皮细胞表面以及血小板聚集
17、中，发挥重要作用。,（四）血管内皮的生长及调控,血管的生长很大程度上依赖血管内皮的生长，无论是新生血管还是损伤血管的修复，都取决于血管内皮的生长。一般情况下，血管内皮的更新速度很慢，大鼠主动脉24小时内更新率小于0.6%。如果人或其他动物血管内皮受损后也是如此慢的速度修复，那一定会发生很多出血或血栓性疾病。目前已知的促进内皮细胞增殖及血管生长的活性物质有：肝素结合性生长因子(heparin binding growth factor, HBGF) ；血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor, PDGF) ；转化生长因子(transforming grow
18、th factor, TGF)有、两种。其中TGF-具有促进内皮细胞增殖作用。,内皮细胞在血栓止血中的作用,1一期止血缺陷 指血管壁和血小板的缺陷。常用筛选试验如下：1）毛细血管脆性试验（capillary resistance test,CRP）2）出血时间（bleeding time, BT） (3)血小板计数（platelet count, Plt） (4)血块收缩试验(clot retraction test, CRT) 目的 结果判断 临床意义 评价,毛细血管抵抗力试验（TourniquetTest, CRT） 原理 对毛细血管壁施加压力，观察血管壁、血管内皮、血小板等综合止血作用。
19、 方法 束臂法 参考值 男性5 女性和儿童20 临床意义 毛细血管抵抗力降低（即脆性增加）见于： Plt减少如ITP、AA Plt功能异常原发或继发血小板减少或增多如血小板无力症 血管性病变如血管性血友病、坏血病等血管通透性增加的疾病。,Bleeding Time Test,Timer is started upon incision,BT = Time to complete cessation of free blood flow,BT（1）,BT（2）,Surgicut instead of lancet. Apply 40 mmHg blood pressure. Take blood
20、 every 30 sec.Normal range: 2-8 min,血管壁（内皮）检验,血管性血友病因子检测血浆血管性血友病因子抗原检测 【参考值】 94.1%32.5%【临床评价】 vWF：Ag检测是临床常用的较为敏感和实用试验之一，是研究和诊断vWD的重要指标。1减低 见于血管性血友病（vWD），是诊断vWD及其分型的重要指标之一。2增高 vWF是一种急性反应蛋白，在很多应激情况下都可增高，常见于血栓性疾，如病心肌梗死、心绞痛、脑血管病变、肾小球疾病、糖尿病、妊娠高血压综合征、大手术后等。,血浆vWF瑞斯托霉素辅因子检测,【原理】 血浆vWF瑞斯托霉素辅因子（vWF ristoceti
21、n cofactor, vWF:Rcof）检测，在瑞斯托霉素存在的条件下，vWF与血板膜GPIb-相互作用，使血小板发生凝集。凝集的强度与受检血浆中vWF的量和（或）质有关。将混合正常人血浆作为100% vWF:Rcof，用缓冲液稀释成不同稀释度，不同稀释度混合正常血浆代替受检血浆在同样条件下测定血小板凝集反应。根据正常血浆的稀释度及其相应的透光度，绘制标准曲线。受检血浆的透光度从标准曲线中计算出受检血浆中vWF:Rcof的含量。【参考值】 50%150%【临床评价】本试验是检测vWF功能活性较敏感而实用的筛选试验，绝大多数vWD病例聚集率减低，而其它诱聚集诱导的血小板聚集率均正常，并且不同类
22、型vWD血浆中vWF:Rcof的含量是不同的，型和型患者减低，B型正常，而型的其它亚型可减低。因此，本试验可作为诊断vWD及其分型的主要指标。,血浆内皮素-1检测,【原理】血浆内皮素-1（endothelin-1,ET-1）检测，ELISA法：用抗兔IgG单抗包被固相载体，加入兔抗ET-1抗体，受检血浆或标准品、酶标记ET-1抗体，然后加底物显色，根据A值从标准曲线上可推算出受检血浆中ET-1的含量。【参考值】 血浆ET-1浓度小于5ng/L。【临床评价】 血浆ET-1检测可作为了解血管内皮的损伤程度，估计心脑血管病患者的疗效和预后，进行血栓性疾病的流行病学研究的一项可靠指标。 血浆ET-1增
23、高见于各种类型心绞痛和心肌梗死发作期、冠状动脉手术患者、原发性高血压、肺动脉高压、原发性醛固酮增多症、高脂血症、缺血性脑中风、急慢性肾衰、支气管哮喘、细菌毒素引起的休克或DIC血管内皮广泛受损时。,血浆血栓调节蛋白检测,【原理】 血栓调节蛋白抗原（thrombomodulin antigen TM:Ag）检测，采用酶联兔疫吸附双抗体夹心法，包被单克隆抗TM抗体，待测血浆中TM与包被抗体结合后，加入过氧化物酶抗体，三者形成复合物，然后与邻苯二胺作用，呈现显色反应，其颜色的深浅与TM含量成正比。【参考值】 （2552）g/L【临床评价】 TM是由内皮细胞合成和分泌，具有十分重要的抗凝作用。正常情况
24、下，血浆中TM水平很低，当血管内皮损伤后，血浆TM水平明显升高，且与损伤程度相关。目前认为，TM：Ag检测是了解血管内皮损伤的最好指标。此外，在DIC病理生理过程中，通过TM水平的改变，还能估计其疗效和预后情况。 血浆TM水平增高常见于糖尿病、SLE、DIC、急性心肌梗死、血栓性血小板减少性紫癜、溶血性尿毒症综合征、脑血栓、白血病等。血浆TM水平下降没有太大的价值。,血浆6酮-前列腺素F1a检测,【原理】 血浆6酮-前列腺素F1a(6-Keto-PGF1a)检测，ELISA法：将抗原（6-酮- PGF1a牛血清白蛋白连接物）包被酶标反应板，加入受检血浆或6-酮- PGF1a标准品和一定量的抗6
25、-酮- PGF1a抗血清，作用一定时间后，再加入酶标记第二抗体，最后加入底物显色。标准品或受检血浆中的6-酮- PGF1a与包被抗原竞争性地与抗体结合，抗体与包被抗原结合的量与受检血浆或标准品中6-酮- PGF1a的量呈负相关。如受检血浆中抗原的量越高，抗体与包被抗原结合的量也越少。根据显色程度（A值）从标准曲线中计算出受检血浆中6-酮- PGF1a的含量。【参考值】 （17.97.2）Pg/ml。【临床评价】 6-酮-前列腺素F1a是血管内皮细胞膜上PGG2和PGH2代谢的终未产物，检测血浆6-酮-前列腺素F1a水平能客观的反映血管内皮的功能，对血管内皮损伤程度的了解和疗效评价具有一定的价值
26、。 血浆6-酮-前列腺素F1a减低 见于血栓性疾病，如急性心肌梗死、心绞痛、脑血管病变、糖尿病、动脉粥样硬化、肿瘤转移、肾小球病变、周围血管血栓形成及血栓性血小板减少性紫癜等。,Vascular wall disorders,Damage to capillary endotheliumAbnormalities in the vascular subendothelial matrix Defect of extravascular connective tissues that support blood vesselsFormation of abnormal blood vessels
27、.,Defects on Capillary Wall,Hereditary Telangioectasia(毛细血管扩张); Acquired Allergic purpura(过敏性紫癜); Senile purpura Non- thrombocytopenic purpura Severe infection Vitamin C deficiency Uremia,过敏性紫癜,【概述】 过敏性紫癜（allergic purpura），好发于儿童和青年人，20岁以前的发病率占80%以上。发生在10岁以内儿童时，也称许兰一亨诺综合征（Schonlein- Henoch syndrome）。
28、本症是一种变态反应性出血性疾病，主要是由于机体对某些致敏物质（过敏原）发生变态反应而引起全身性毛细血管壁的通透性和（或）脆性增加，导致以皮肤和粘膜出血为主要表现的临床综合征。本病有关的过敏原主要有：感染：细菌、病毒和寄生虫等；食物：鱼、虾、蟹、蛋、奶等；药物：某些抗生素、镇痛解热药和抗结核药等；其他：花粉、昆虫叮咬和预防接种和寒冷性气候等。这些过敏原通过以下两种变态反应引起血管病变：速发型变态反应：由肥大细胞所释放的组胺和白三烯等生物活性物质使毛细血管扩张或通透性增加；抗原抗体复合物：主要是含1gA的兔疫复合物沉积在毛细血管壁上从而激活了补体引起血管炎症性反应。,典型表现分为五型：单纯紫癜型，
29、好发于下肢、关节周围和臀部。紫癜常呈对称分布，分批出现，大小不等，暗紫红色，呈丘疹状或融合成片状，严重时形成大疱，中心有出血性坏死，可伴血管神经性水肿或荨麻疹；关节型，多见于膝、肘、踝、腕等大关节，呈游走性红、肿、痛、热，可伴积液，但不留后遗症，关节症状突出者称为Schonlein purpura；腹型，呈阵发性腹绞痛或持续性钝痛，有压痛但无肌紧张，可伴恶心、呕吐、腹泻、便血，腹部症状突出者称为Henoch purpura；肾型，呈不同程度的蛋白尿、血尿和管型尿，表现为局灶性、节段性和增殖性肾小球肾炎，严重者可有高血压、少尿、浮肿和肾功能异常；混合型：指上述两型或两型以上同时出现者。,【检验】
30、 本症缺乏特异性检验结果。发作时可有白细胞数、中性或嗜酸性粒细胞增高。骨髓象、血小板计数、血小板功能试验、凝血和纤溶试验均正常。2550的病人可见尿液改变、肾功能异常、束臂试验（CFT）阳性、血沉增快、血清1gA增高。此外病变血管兔疫荧光检查可见1gA与补体复合物的颗粒沉积，此对确诊较有价值。,【诊断】 国内诊断以临床表现有紫癜，尤其是大关节附近的对称性斑丘疹样紫癜为主，并存在前驱症状或过敏史，或有其他类型紫癜的相关表现；血栓止血实验检查除束臂试验可能阳性外，其余均无明显异常；病变部位血管周围显示有IgA或C3沉着是最具特征性的诊断指标，但未见IgA或C3沉着不能排除本病可能。过敏性紫癜的最后诊断还需除外各种其他疾病引起血管炎。,
