1、CAR-T联合移植治疗复发难治ALL,温州医科大学附属第一院血液科俞康,难治性白血病诊断标准经标准方案治疗2个疗程无效的初治病例CR后经过巩固强化治疗，6个月内首次复发在6个月后复发但经常规治疗无效者再次或多次复发者髓外白血病持续存在 全国第四届难治性白血病学术研讨会，,复发性白血病诊断标准（符合下列条件之一）诱导化疗获得CR的AL患者骨髓原始细胞大于5但少于20，经过一疗程标准化疗未获得完全缓解。诱导化疗获得CR的AL患者骨髓原始细胞大于20。髓外出现白血病细胞浸润。,难治性白血病的主要原因,白血病细胞对化疗药物产生耐受原发耐药：化疗之前即存在继发耐药：反复化疗诱导白血病细胞产生耐药正常造血
2、干细胞功能衰竭,难治性白血病的治疗原则,常用的方法使用无交叉耐药的新药组成联合化疗方案中、大剂量化疗临床试验异基因造血干细胞移植使用耐药逆转剂新的靶向治疗药物或生物治疗,复发、难治性AML患者的治疗选择大剂量Ara-C再诱导治疗中剂量Ara-C为基础的方案（FLAG或联合蒽环、蒽醌类药物）再诱导治疗二线药物再诱导治疗临床试验异基因造血干细胞移植（二线方案获得CR后再移植或直接移植）,虽然化疗治疗儿童急性淋巴细胞白血病取得很好的疗效，70% 以上患者可获得5年以上长期生存，但在成人ALL疗效仍然很差，尤其是复发难治性急性淋巴细胞白血病的患者预后极差，甚至即使接受挽救性造血干细胞移植治疗，大多患者
3、仅能获得短期病情控制，如果是在异基因造血干细胞移植之后复发或无条件接受移植治疗，该类患者基本上处于无药可救境地。,近期CD19嵌合抗原受体技术在治疗儿童和成人复发B-ALL方面初步显示出很好疗效，近两年的ASH会议上均有所报道。为了强调这个领域的重要性，CAR-T疗法成为2014、2015年ASH年会中的一个重点。 这种新型疗法为复发难治性B-ALL患者带来了一线生机，尤其给那些此前各种实验疗法均失败、无药可治的患者带来了希望。,CAR-T细胞治疗恶性肿瘤有多重优势：短时间内扩增肿瘤特异的T细胞群，靶抗原的非HLA依赖，可反复多疗程使用等。但作为是一种刚刚应用于临床的新型治疗方法，还存在很多问
4、题和未确定因素需要进一步研究和探索，包括“CAR-T细胞最基本的质量标准参数的制定和监控，回输的最佳时机和方式，治疗相关不良反应及其控制，以及近期、远期确切的治疗效果等等”。尤其对中国的患者临床疗效如何？,病例选择：1.1 复发难治性急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）患者经其他传统治疗手段无效，治疗前确认白血病细胞CD19+。,复发难治性急性B淋巴细胞白血病定义：初治病人对标准诱导化疗无效（ALL 1个疗程，AML两个疗程）；在首次缓解6个月内、即早期复发的白血病；虽然在首次缓解6个月后复发，但以原方案再诱导 治疗失败者； 2次或2次以上复发的患者。,1.2 患者自愿入组参加，依从性好，能全程
5、配合试验观察，一般情况尚好，心、肝、肾功能基本正常，无重症感染，采血时外周血CD3+T淋巴细胞计数必须0.8x109/L。,T淋巴细胞数量和亚型的评估,白血病细胞表面抗原CD19的检测和鉴定,2. 治疗方法： 用逆转录病毒载体导入CD19 CAR的自体T细胞（CAR-T-CD19）输注给患者，输注剂量为 5108无上限，分3-5次回输。,回输前对体外制备的CAR-T细胞进行质量检测和鉴定：1）基本指标：数量、活性度、有无病原体等污染。2）靶抗原转染率和细胞杀伤功能。,对照组,转染组,RT-PCR检测转染结果,CD19,GAPDH,CAR质粒,患者,阳性对照,阴性对照,CAR质粒,患者,阳性对照
6、,阳性对照,相对定量-Cp值与内参,Cp值,注：L2为患者细胞，X1为另一组感染效率的对照细胞，NC为经过相同时间周期培养的未感染的T细胞（NC-CD19的Cp值超过35，说明样品中没有模板）。左侧CD19的引物位于CAR的scFv上，正常的T细胞不表达；右侧为GAPDH，作为上样内参；,Cp值平均数,FCM检测转染结果,未转染细胞 转染后细胞,回输前T细胞亚群检测,CAR-T细胞回输前1周内，除予以小剂量环磷酰胺(0.3g/M2 iv. -6d,-5d,-4d) 进行预处理帮助删除抑制性淋巴细胞之外（也有患者采用FC），禁用其他一切细胞毒药物和免疫抑制剂。回输时至少由三人（医生、护士和细胞制
7、备技术人员）对患者的姓名、性别、年龄、住院号、细胞培养序列号和质控报告单等资料进行严格核对，确认无误后再行回输，回输过程中密切观察患者情况。,3. 观察指标：1）安全性，患者接受CAR-T-CD19治疗，可能出现的 各种相关不良反应及患者耐受性。2）CAR-T-CD19体内清除白血病细胞效能。3） CAR-T-CD19在体内持续存留的时间。,4. 结果1）6例成人接受CAR-T-CD19治疗患者的一般情况,4. 结果2）安全性：所有患者在回输细胞后均出现不同程度的发热，一般均在37 38 ，偶然最高可达39以上，但均为一过性，无畏寒、寒战、心慌、胸闷等不适，无需特殊处理或仅用物理降温即可退热。
8、第1例患者在回输CAR-T 2周后复查骨髓发现有嗜血现象，无其他严重毒副反应。,被巨噬细胞吞噬的成熟红细胞,原始细胞（白血病细胞）,第1例：CAR-T回输后15d骨髓涂片细胞学检查（ BM细胞）,原始细胞（白血病细胞）,回输后15d BM细胞,回输后33dBM细胞,骨髓增生极度低下,4. 结果3）临床疗效（反应率）,3例外周血和骨髓均达到完全缓解，2例PR，1例病情稳定。1例PR患者因长期粒缺、合并肺部重症感染死亡。,第1例：治疗前骨髓中的白血病细胞70%,第1例：治疗后15d骨髓中的白血病细胞 20%,FCM检测治疗后白血病细胞清除效率,1）2015-06-11（回输前）,2）2015-07
9、-01 （回输后7d）,3）2015-07-10 （回输后17d）,4）2015-07-27（回输后33d）,CD34,第1例,SSC,1）2015-06-11 （回输前）,2）2015-07-01 （回输后7d）,3）2015-07-10 （回输后17d）,4）2015-07-27（回输后33d）,CD19,FCM检测治疗后白血病细胞清除效率,第1例,第2例,治疗前 BM BC 80%,治疗后22d,60d BM 完全缓解（ BC 5%）,第2例,治疗前,第2例,治疗后22d,第3例,治疗前 BM BC 70%,治疗后 BM BC 35%,4. 结果4）CAR-T在体内持续存留时间 第2例C
10、AR-T回输后第60天，骨髓和外周血CR。PB-RT-PCR 可检出CAR-T特异性核苷酸片段。3个月时测不出。,第4例：CAR-T回输后第30天，骨髓和外周血细 胞学CR。bcr/abl（T315I突变）融合基因 P210 19.3%阳性 PB-RT-PCR 可检出微量CAR-T特异性核 苷酸片段。,微弱阳性,讨 论,一、CAR-T治疗的安全性：CAR有多安全？迄今为止报道的CAR T治疗相关副作用：1.细胞因子风暴，肿瘤裂解效应、外周血中CAR-T细胞的数量和促炎症细胞因子的水平直接相关。2.靶向细胞毒性， B细胞再生性贫血障碍或瞄定CD19分子而引起的低丙种球蛋白血症。 3.神经系统毒性
11、，几个研究组在用CAR-T治疗白血病的过程中，观察到少部分患者出现神经错乱，语言障碍，癫痫等神经系统不良反应。 4.其他合并的免疫炎症反应，巨噬细胞活化，类自身免疫性疾病等。,第1例患者 CAR-T细胞回输后虽然骨髓中白血病细胞明显减少，但始终未能恢复正常造血，最终因持续粒细胞缺乏，肺部重症感染离世。分析原因：治疗前患者一般情况极差，查PB ：WBC 0.73109/L, N 6.8%, Neu 0.05109/L, Ly 93.2% 0.68x109/L Hb 26g/L，PLT 10109/L，骨髓中原始细胞73%。经长期使用IL-2和支持治疗后，患者勉强达到采血标准。既往长期反复强化疗，
12、损伤正常造血干祖细胞，有继发再障、MDS可能。既往化疗时，曾反复合并肺部重症感染（包括肺真菌病），容易再次激活。不排除巨噬细胞活化加重或延长粒细胞缺乏， 患者出院后再次入院时查PB：WBC 0.2109/L, N 30%, Neu 0.06109/L, Ly 65% 0.13x109/L ，Hb 49g/L，PLT 15109/L 。,二、清除白血病细胞的效能和临床疗效1）宿主因素： 白血病细胞自身的生物学特性，如增殖活性，浸润能力，干扰或逃逸免疫杀伤的能力等等。 既往用药和患者接受治疗时的基本免疫水平。,早期和目前的研究着重于稳定产生肿瘤靶向的T细胞，而肿瘤周围抑制性的微环境却可能使CAR-T细胞变得毫无效用。因此，未来这一疗法的研究方向还应该考虑消除肿瘤微环境中负向免疫因子对CAR-T细胞的凋亡诱导和抑制作用。,二、清除白血病细胞的效能和临床疗效2）细胞因素：体外制备CAR-T细胞的技术水平，细胞数量、靶向性、杀伤活性和持久性为过继性细胞免疫治疗的几个要素。能否获得足够数量的CAR-T细胞？靶抗原的特异性和转染效率？杀伤功能和在体内持续存活的时间？3） 回输CAR-T细胞前后的免疫调节：是否需要预处理？如何处理？回输前后是否需要联合使用IL-2等免疫细胞因子？,谢谢！,
