1、细菌 dna 提取方案第 1 页 共 4 页细菌 DNA 提取方案细菌 DNA 提取方案：革兰氏阴性菌，如 E.coli，一般有三种可以选择的方法。一、水煮模板法主要用于 PCR 反应1、接种单菌落于 LB 或脑心平板，连续画线，37 摄氏度培养 1824 小时。2、刮取 12 接种环菌苔加入 150 微升三蒸水中，混匀，100 摄氏度煮沸 10 分钟。3、12000 转/分钟 离心 10 分钟，取上清，20 摄氏度保存备用。操作最简便，对试剂条件要求低。缺点是纯度不够高，可能会含有 RNA、蛋白等杂质。但是作为一般检测目的的 PCR 反应模板已经足够了。有人称扩增 4kb 以下片段都可用此种
2、方法制取模版，编者用此类模板 PCR 可以扩增到 3500bp 的片段。编者建议：此法得到的模版保存时间短，强烈建议每月重新制作一次。二、CTAB/NaCl 法1、接种一单菌落于 5mlLB 中,30培养过夜,2、取 1ml 种子培养液接入 100ml2%LB 中,37 、220r/min 培养 16 小时;3、5000r/min 离心 10 分钟,弃去上清。4、加入 10mlTE 离心洗涤后,用 10mlTE 溶解菌体,混匀,-20 保存备用。5、取 3.5ml 菌悬液,加入 184l10%SDS,混匀, 加入 37l10mg/ml 蛋白酶 K,混匀,37温育 1 小时6、加入 740l5m
3、ol/LNaCl,再加入 512lCTAB/NaCl,混匀,65温育 10 分钟。7、加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10000r/min 离心 5 分钟,保留上清。8、上清中加入等体积的酚氯仿 异戊醇(25241),混匀,10000r/min 离心 5 分钟,保留上清。9、加入 0.6 倍的异丙醇,混匀,10000r/min 离心 5 分钟, 收集 DNA 沉淀,用 70%乙醇离心洗涤 DNA 沉淀。10、用 1mlTE 溶解 DNA,加入终浓度为 20g/mlRNaseA,4保存。CTAB/NaCl 法提取的 DNA 纯度较高，蛋白杂质较少，保存时间长，编者更喜欢把终浓度为 20g/ml
4、RnaseA加在第 5 步温育的时候，这样最后没有 RnaseA 污染。每一步操作细致一些，得到的 DNA 可用于 Southern 细菌 dna 提取方案第 2 页 共 4 页blot。编者建议：长时间保存 DNA 可放于-20，但要尽量减少反复冻融，否则影响 DNA 质量。三、盐析法1、1.5ml 对数期菌液2、12000rpm 30 s3、200ul 裂解液（同 CTAB/NaCl 法），37c,1hr4、66ul 5M NaCL,混匀充分，12000rpm 10min5、上清用粗枪头取至新管6、等体积酚充分混匀，12000rpm 3min，反复抽提至无蛋白层7、取水层，等体积氯仿混匀，
5、12000rpm 3min8、上清至新管，2 倍体积预冷无水乙醇9、-20C，20min，14000rpm， 15min10、 400ul 70%冷乙醇洗涤11、干燥，100ul 20ug/ml RNaseA，37C，30min12、 2 倍体积无水乙醇沉淀，70%冷乙醇洗涤13、干燥，溶于 100ul TE介于方法一和方法二之间，CTAB 虽然取出糖分效果较好，但 CTAB 本身也是有毒的，所以此方法放弃了CTAB。革兰氏阳性菌，由于细胞壁的结构与阴性菌有差别，裂解比阴性菌稍微麻烦一些，可以采取 CTAB/NaCl 法稍加修改，在第四步加入终浓度 2mg/ml 的溶菌酶，37 度温育 1h。
6、实验注意：提基因组最好要将枪头尖剪掉（剪掉以后在酒精灯上迅速过一下，使其断口圆滑）。以免枪头损伤基因组！抽干时最好是风干！细菌基因组 DNA 的提取方法综述，提供了 5 种方法。1 快速微量提取法A.取 1.5ml 菌体培养物于一灭菌 Ep 管中，12000rpm 离心 1min, 丢去上清夜，收集菌体。B.加入 400ul 裂解液（40mMTris-醋酸，20mM 醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于 37oC 水浴 1hr。细菌 dna 提取方案第 3 页 共 4 页C.然后加入 200ul5mol/L 的氯化钠溶液，混匀后于 13000rpm 离心 15min。D.
7、取上清液，用苯酚抽提 2 次，氯仿抽提 1 次。E. 加两倍体积无水乙醇，1/10 体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20 度保存 1 小时后，13000rpm 离心 15min，弃上清液，沉淀用 70%乙醇洗 2 次；置于室温干燥后，溶于 50ulTE溶液中，置 4保存备用。2 蛋白酶/SDS 法制备先用 10ml 含适当抗生素的 GBM 过夜培养 Delftia sp.，第二天 4000rpm 离心 10min 收集菌体，用 Washing TE（ 50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体 2 次，之后将菌体充分悬浮在 5ml 1TE 缓
8、冲液中，先后加入 0.5ml 5mg/L 的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后 50放置 3h5h，接着用等体积的 Tris 饱和苯酚抽提 2 次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀 DNA，用自动移液器吸管头将絮状 DNA 沉淀块吸附到 Ep 管中， 70%乙醇洗 2 次，干燥后溶于适当 1TE 或 ddH2O 中。31) 细菌培养：细菌接种于 5ml 液体培养基中，37摇床（300rpm）培养过液。2) 细菌收集：取 1ml 培养物于 1.5ml EP 管中，室温 8000rpm 离心 5min，弃上清，沉淀重新悬浮于 1ml TE（pH8.0）中（用 ddH
9、2O 也行)。3) 菌体裂解：加入 6l 50mg/ml 的溶菌酶，37作用 2h。再加 2mol/LNaCl50l，10%SDS 110l，20mg/ml 的蛋白酶 K 3l，50作用 3h 或 37过夜。 （此时菌液应为透明粘稠液体）4) 抽提：菌液均分到两个 1.5ml EP管，加等体积的酚氯仿异戊醇(25241)，混匀，室温放置 5-10min。12000rpm 离心 10min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）5) 沉淀：加 0.6 倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。1 2000rpm 离心 10min。6)洗涤：沉淀用 75%的乙醇洗涤。7) 抽（凉
10、）干后，溶于 50l ddH2O 中，取2-5l 电泳。作 PCR 模板用。4. DNA EXTRACTION PROCEDURE - GENERAL1) Grow cells overnight in 500 ml broth medium.2) Pellet cells by centrifugation, and resuspend in 5 ml 50 mM Tris (pH 8.0), 50 mM EDTA.3) Freeze cell suspension at -20C4) Add 0.5 ml 250 mM Tris (pH 8.0), 10 mg/ml lysozyme to
11、 frozen suspension, and let thaw at room temperature. When thawed, place on ice for 45 min.5) Add 1 ml 0.5% SDS, 50 mM Tris (pH 7.5), 0.4 M EDTA, 1 mg/ml proteinase K. Place in 50C water bath for 60 min.6) Extract with 6 ml Tris-equilibrated phenol and centrifuge at 10,000X g for 15 min. Transfer to
12、p layer to new tube (avoid interface). Re-do this step if necessary.7) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting).Spool out DNA and transfer to 5 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, 200 g/ml RNase. Dissolve overnight by rocking at 4C.8) Extract with equal vo
13、lume chloroform (mix by inverting) and centrifuge at 10,000X g for 5 min. Transfer top layer to a new tube.9) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting).10) Spool out DNA and dissolve in 2 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA.11) Check purity of DNA by electro
14、phoresis and spectrophotometric analysis.51) 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm 离心 10 分钟, 去上清液。 2) 加 9.5ml TE 悬浮沉淀, 并加 0.5ml 10% SDS, 50l 20mg/ml(或 1mg 干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37保温 1 小时。3) 加 1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。4) 加 1.5ml CTAB/NaCl 溶液, 混匀, 65保温 20 分钟。5) 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm 离心 10 分钟, 将上清液移至干净离心管。6) 用等体积氯仿:
15、异戊醇(24:1) 抽提, 取上清液移至干净管中。7) 加 1 倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止 10 分钟，沉淀 DNA。8) 用玻棒捞出 DNA 沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于 1ml TE, -20保存。如 DNA 沉淀无法捞出,可 5000rpm 离心, 使 DNA 沉淀。9) 如要除去其中的 RNA, 可以按本章第三节中操作步骤处理。注：1)CTAB/NaCl 溶液：4.1g NaCl 溶解于 80ml H2O,缓慢加入 10g CTAB,加水至 100ml。 2)氯仿: 异戊醇(24:1)，酚:氯仿: 异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% S
16、DS，蛋白酶 K (20mg/ml 或粉剂)，5mol/L NaCl。本方法通过 SDS 裂解细胞，蛋白酶降解蛋白， CTAB 去除多糖成分一：仪器：同方法一 二：试剂：TE、 TAE 缓冲液；10%SDS；NaCL；20mg/ml 蛋白酶；CTAB/NaCL 溶液(10% CTAB，0.7M NaCL 4.1gNaCL 溶于 80ml 水中，缓慢加入 10gCTAB，加热溶解)；25/24/1,酚/氯仿/异戊醇; 24/1,氯仿/异戊醇；异丙醇；及 100%乙醇三：操作 1.5ml 对数生长期细菌细胞 离心，5000rpm,1min 沉淀 溶于 500l TE 缓冲细菌 dna 提取方案第 4 页 共 4 页液中混匀 30l 10%SDS,3L 蛋白酶，混匀，37,1 小时 100l NaCL(5M) 混匀 80l 的 CTAB/NaCL,*混匀；65 10min（可不做） 加入等体积酚/氯仿/ 异戊醇混合液，混匀，离心 12000rpm,4-5min 取上清，以下操作与方法一中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除 RNA 、复溶等步骤一致。注意 ，*此步操作后，离心管中NaCL 的浓度不应低于 0.5M，否则 DNA 将与 CTAB 共沉淀。 2,本法适用于从多糖含量高的样品中提取DNA。对于菌体样品,通过此流程, 可以获得较为完整的 DNA 分子。
