1、载体构建分为以下步骤：1.载体的选择和引物设计以扩增目标基因2.目标片段的 PCR 扩增3.载体和目标片段的限制性酶切4.连接转化5.挑取克隆提质粒6.单克隆的验证及送样测序。载体的选择实验室常用的载体有 pUC19（扩繁目标片段），pet28a（原核表达载体 Kna+），pGEX-4T-1(原核表达载体 Amp+)，pCI-NEO(真核表达载体 Amp+)，pCDNA3.1(真核表达载体 Amp+)，pLKO.1(shRNA 构建 Amp+)。根据所要构建的质粒目的的差异以及载体和目标片段的酶切位点分析结果来选择载体。举例如下：实验目的是将 MYC 基因插入到载体中，转染进细胞中表达。应选用
2、真核表达载体 pCI-NEO或 pCDNA3.1。引物设计引物设计的目的是将目标片段扩增出来以便与载体连接，所以在引物的两端应人为加上酶切位点，酶切位点前加上保护碱基。在选择酶切位点是应注意，选择的应该是目的基因片段中没有而载体上有的限制性内切酶，防止目标片段被切不完整，也便于和载体连接。载体构建之后我们的目的是要表达，所以应该加入标签以便 western blot 检测蛋白是否表达。常用的标签有 Flag 标签、6XHis 标签、HA 标签和 Myc 标签。Flag 标签：D Y K D D D D KGAT TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAG6XHis 标签：H H H
3、 H H HCAC CAC CAC CAC CAC CACHA 标签：Y P Y D V P D Y ATAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GCTMyc 标签：E Q K L I S E E D L这些标签被表达成氨基酸后，特定的氨基酸序列会与相应抗体结合，在 western blot 时可被检测。因此，在设计引物时，这些核酸序列应位于起始密码子 ATG 之后。翻译是从 mRNA 的 5端开始，而蛋白质合成是从 N 端到 C 端，所以若要把标签加在 N 端，标签所对应的核苷酸序列应位于 ATG 之后，若是加在 C 端，则应该将标签所对应的核苷酸序列置于终止密码子 T
4、AA 之前。对于真核表达载体，蛋白在真核生物中表达时切记应加入 kozak 序列，kozak 序列是核糖体在识别 mRNA 上起始位点时的必须元件，蛋白在翻译表达时时从 kozak 序列后的第一个ATG 开始翻译。并且，kozak 序列的存在可以使蛋白的翻译表达效率提高很多倍。根据以上原则，仍然以 MYC 为例：1.在 NCBI 中查找 MYC 的 CDS 序列。2.将序列复制粘贴至 DNAMAN 中分析：在这些不含有的酶切位点中选择与载体对应的酶切位点，本次举例选择 pCDNA3.1所选择的酶切位点为 KpnI 和 XhoI.引物设计如下： 酶切位点 Flag 标签MYC-PCD-KpnI-
5、Flag-F:GG GGTACC GCCACC ATG GATTACAAGGATGACGACGATAAG 保护碱基 kozak atg GATTTTTTTCGGGTAGTGGAMYC 上游引物酶切位点 MYC 下游引物MYC-PCD-XhoI-R:CC CTCGAG ATT CGCACAAGAGTTCCGTAGCT保护碱基 终止子目标片段的 PCR 扩增和回收因为后续将目的片段插入之后做的是表达，所以不能引入突变，我们实验室用的是 Q5 高保真酶，PCR 扩增体系如下：Q5 reaction Buffer 10ulQ5 GC enhancer 10ul模板 gDNA(50ng)/cDNA(25
6、ng)/质粒(0.1-1ng)/PCR 产物(0.01-0.1ng)dNTP(10mM) 1ulF（ 10uM） 1ulR（10uM ） 1ulQ5 0.5ulddH2O to 50ulPCR 扩增时是呈指数增长，即使只有少量模板，也能得到大量的目标片段，反之若模板含量过多，则会是的引物与模板非特异结合，扩增出非特异片段。引物也不宜加多，引物过量会使得引物自身之间相互结合，扩增之后产生过多的引物二聚体。获得 PCR 产物之后，产物里有酶，dNTP,引物二聚体和目标片段，所以需要切胶回收获得较纯的目标片段。切胶回收组内有相应的试剂盒，流程如下：（1 ） 紫外灯下切除含有目的基因的琼脂糖凝胶，用纸
7、巾吸尽凝胶表面的液体，尽量减少不含目的基因的凝胶量，称重（1mg=1ul），切碎凝胶，装入 2mL PCR 管中。（2 ） 加入 3 倍体积的 Buffer A 溶液，75水浴锅加热直至凝胶完全融化。（3 ） 加入 1/2Buffer A 体积的 Buffer B ，观察溶液颜色由红变黄，并无明显颗粒，表示凝胶融化完全。（4 ） 吸取上述步骤中的溶液并转移到制备管（置于 2 ml 离心管（试剂盒内提供）中） ，12,000g 离心 1 min，弃滤液。 （5 ） 将制备管置回离心管，加 500 l Buffer W1，12,000g 离心 1 min，弃滤液（6 ） 将制备管置回离心管，加 7
8、00 l Buffer W2，12,000g 离心 1 min，弃滤液；以同样的方法再用 700 l Buffer W2 洗涤一次。弃滤液。* 两次使用 Buffer W2 冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。 （7 ） 将制备管置回 2 ml 离心管中，12,000g 离心 1 min。 （8 ） 将制备管移入新的 1.5 ml 离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加 2540l Eluent，室温静置 1 min。12,000g 离心 1 min。 载体质粒的扩繁转化（1 ） 取 2l 质粒加到 1.5mLEP 管中，并放置于冰上。（2 ） 取 30l 大肠杆菌 DH5 感
9、受态细胞加入质粒中，冰上放置 30min。（3 ） 将水浴锅调至 42，将上述混合液放在水浴锅中热激 1min30s。（4 ） 取出热激后的混合液，冰上放置 2min，加 300ul SOC 培养基。（5 ） 再放置 37，190rpm 摇床上培养 1 小时（6 ） 取 50ul 涂布相应抗性的 LB 固体培养基，放在 37温箱中过夜培养。质粒提取（1 ） 挑取培养基上的单菌落于含有 10ml 液体 LB 培养基的 50ml 培养瓶中 37过夜培养（2 ） 取 1-4 ml 上述过夜的菌液 12,000g 离心 1 min，弃尽上清。（2 ）加 250 l Buffer S1 悬浮细菌沉淀，悬
10、浮需均匀，不应留有小的菌块。 * 确认 Buffer S1 中已加入 RNase A。 （3 ）加 250 l Buffer S2，温和并充分地上下翻转 4-6 次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过 5 min。 * Buffer S2 使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中的 CO2 中和 Buffer 的 NaOH，降低溶菌效率。* 避免剧烈摇晃，否则将导致基因组 DNA 的污染。* 此步骤不宜超过 5 min。 （4 ）加 350 l Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合 6-8 次，12,000g 离心 10 min。 * 避免剧烈摇晃，否则将导致基因组 DNA
11、 的污染。 （5 ）吸取步骤 4 中的离心上清并转移到制备管（置于 2 ml 离心管（试剂盒内提供）中） ，12,000g 离心 1 min，弃滤液。 （6 ）将制备管置回离心管，加 500 l Buffer W1，12,000g 离心 1 min，弃滤液。 （7 ）将制备管置回离心管，加 700 l Buffer W2，12,000g 离心 1 min，弃滤液；以同样的方法再用 700 l Buffer W2 洗涤一次。弃滤液。 （8 ）将制备管置回 2 ml 离心管中，12,000g 离心 1 min。 （9 ） 将制备管移入新的 1.5 ml 离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加
12、60-80 l Eluent，室温静置 1 min。12,000g 心 1 min。 （10 ）取 1l （9）中溶液进行凝胶电泳检测。载体和目标片段的限制性酶切酶切时注意以下原则：1.buffer 的体积应大于等于酶的体积；2.酶量宜少不宜多，酶反应时间可适当延长；3.酶切时间不能太长，否则会乱切；4.酶切体积不应过小，否则会影响酶切效率；5.添加酶时可按照 1ul 切 1ug 质量来计算。酶切体系如下（举例）：10Xbuffer 3ul酶 1 1ul酶 2 1ul目的片段/载体 1ugddH2O to 30ul37酶切 3-4h 即可。酶切产物应进行回收才可继续后续的连接转化工作，回收的步
13、骤同 PCR 产物回收。注：上述讲述的均为双酶切，有时候我们需要使用单酶切来做载体和片段的连接，这时载体容易自身连接形成假阳性菌斑，所以在载体酶切后对载体进行脱磷，之后在进行切胶回收。脱磷时只需在酶切体系中加入 10Xbuffer 和 0.5ul 的去磷酸酶，37 过夜。核苷酸中的磷酸基团在合成核酸时，磷酸基团位于 5端。在连接时，脱磷后的载体自身连接效率极低，因为两端都没有磷酸基团，不会形成一端连接的缺克，多呈线性，所以连接出来的斑基本都是目标片段和载体的阳性克隆。但应该在做连接时，做一个载体自连的阴性对照。阴性对照应基本不长斑，而目标片段和载体的连接产物长出的斑应远远大于阴性对照，结果才可
14、靠。连接转化连接体系如下：10Xbuffer 1ulT4 连接酶 1ul载体 0.01pmol目的片段 0.1pmol水 to 10ul连接条件可以使 252h，也可以 16过夜（12-16h）转化同上。挑取克隆提质粒平板长出的斑不免存在假阳性，所以在挑菌时应该多挑单克隆，提质粒后进行酶切验证，送阳性克隆测序。挑菌在超净工作台进行，应严格无菌操作，在使用前将所需器材放进超净工作台（除平板）紫外照射 20min 后方可操作。质粒抽提步骤同上。单克隆的验证及送样测序挑取阳性克隆提质粒后，应进行验证，对于双酶切连接，采取的是双酶切验证，在验证时体系同酶切连接时类似，但酶量应减少，每个反应体系加 0.1ul 酶，质粒加入 100-200ng 即可。对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，阳性克隆会出现两条带，一条是与载体大小相同，一条与目的片段大小相同。在验证时应做阴性对照，即对载体进行相应的双酶切，其酶切产物只有一条带。对于单酶切的连接，因为是同样的酶切位点，所以在连接时，可能是 ATG 在前，也有可能是 TAA 在前，而我们需要的是 ATG 在前。应采用 PCR 的方法验证，在载体上设计一段引物F，与目标片段的 R 引物一起扩增，只有插入顺序正确的质粒才能扩增出目的片段，错误的无法扩增。将验证后确定正确的阳性克隆质粒送样测序。
