1、免疫球蛋白,抗体（antibody，Ab)：B细胞在Ag刺激下，产生能与相应Ag发生特异性结合的免疫球蛋白。免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）：具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。Ab和Ig具有不同之处 Ab是Ig，但Ig不一定是Ab免疫球蛋白可分为分泌型(secreted Ig，SIg)和膜型(membrane Ig，mIg)。 Ab介导的免疫称为体液免疫。,Emil von Behring (1845-1917),1901, antitoxinsantibody,是介导体液免疫的重要效应分子，是B细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的球蛋白。,一、免疫球蛋白的基本结
2、构,四条肽链结构Ig的基本结构是四条肽链的对称结构 2H+2L=Ig单体,一、免疫球蛋白的基本结构,重链：免疫球蛋白重链分子量约为5075kDa，由450550个氨基酸残基组成，并结合有不同糖基，因此免疫球蛋白属糖蛋白。H链：、 IgM IgG IgA IgD IgE,不同类的免疫球蛋白，其链内和链间二硫键的数目和位置、连接寡糖的数量、结构域的数目及铰链区的长度等均不完全相同,同一类免疫球蛋白，其铰链区氨基酸的组成和重链二硫键的数目等也不同，据此又可将同类免疫球蛋白分为不同亚类(subclass)。,一、免疫球蛋白的基本结构,轻链：免疫球蛋白轻链分子量约为25kDa，由214个氨基酸残基组成。
3、根据轻链结构和抗原性的不同分为(kappa)链和(lambda)链，免疫球蛋白因此分为两型(type)，即型和型。各类免疫球蛋白轻链均有型和型，两型轻链的功能无差异。正常人血清免疫球蛋白的型: 型约为2:1，在小鼠则为20:1。,一、免疫球蛋白的基本结构,可变区和恒定区可变区（Variable Region，V区）：位于Ig分子N端，占轻链1/2和重链1/4或1/5；不同抗体其IgV区氨基酸组成和排列有较大差异，并决定抗体与抗原结合的特异性；,H:30-35;50-63;95-102; L:23-34, 50-60,89-97;,一、免疫球蛋白的基本结构,可变区和恒定区高变区（hypervar
4、iable region, HVR），或称互补性决定区（complementarity-determining region，CDR）: VH和VL可变区内各有3个区域的氨基酸组成和排列顺序变化特别大，共同组成一个与抗原决定基互补的表面，即抗原结合部位。用HVR1-3或CDR1-3表示。一般CDR3的变化程度最高。CDR决定了抗体的特异性。 独特型决定簇：与特异性抗原结合的部位。骨架区（Framework region,FR）,一、免疫球蛋白的基本结构,可变区和恒定区恒定区（Constant Region，C区）:位于Ig 分子的C端，占轻链1/2和重链3/4（IgA、IgD）或4/5（IgM
5、、IgE）。在同一种属中，同一类重链和同一类轻链C区氨基酸的组成或排列比较恒定。介导Ig多种生物学功能。重链和轻链的C区分别称为CH和CL，不同型免疫球蛋白的CL长度基本一致，但不同类免疫球蛋白的CH长度不尽相同，可从CH1CH3或CH1CH4。,一、免疫球蛋白的基本结构,铰链区 CH1和CH2之间, 由30个氨基酸组成的富含脯氨酸的结构称为铰链区。 功能：（1）利于Ig CDR与Ag决定簇吻合；（2）与Ag结合后，“T”转变为“Y”型，补体结合点暴露,二、免疫球蛋白的功能区,结构域：Ig的多肽链分子中约110个氨基酸可折叠成由链内二硫键连接的具有特定功能的球形结构。称为免疫球蛋白的功能区或结
6、构域（domain）., VL和VH: 抗原结合部位 CL和CH1:同种异型的遗传标记所在处 CH2和CH3： IgG的CH2和IgM的CH3: 补体C1q结合点； 母体的IgG借助CH2通过胎盘进入胎儿体内 CH3、CH4: 与细胞Fc受体结合的部位 IgG的CH3可结合细胞表面的FcR，IgE的CH2和CH3可与肥大细胞和嗜碱性粒细胞的IgE Fc受体结合。,二、免疫球蛋白的功能区,二、免疫球蛋白的功能区,Ig超家族（IgSF）：与Ig结构相似、遗传基因同源的蛋白分子，它们主要以膜蛋白的形式存在于细胞表面。编码IgSF的基因称为Ig基因超家族。IgSF以单体、二聚体或多聚体的形式分布于各类
7、细胞表面，参与细胞间相互识别和相互作用，可介导细胞间的黏附和信号传导，参与免疫应答、炎症反应以及淋巴细胞归巢。,三、免疫球蛋白的其他成分,J链：由浆细胞合成、富含Cys的多肽链，连接Ig 单体形成多聚体，如IgA二聚体和IgM五聚体的形成。分泌片（SP）：由粘膜上皮细胞产生的含糖肽链，为分泌型IgA的辅助成分，可以非共价形式结合到IgA二聚体上，并一起分泌到粘膜表面。作用机理：保护铰链区的酶解，介导二聚体的跨膜转运。,SIgA参与黏膜局部免疫,四、免疫球蛋白的酶解片段,木瓜蛋白酶 2 Fab 结合Ag 1 Fc 可结晶，保留Ag性及相应功能区的功能胃蛋白酶: 1 F(Ab)2 结合Ag，双价
8、pFc 无活性碎片意义：免疫球蛋白酶解片段的研究不仅对阐明免疫球蛋白的结构和生物活性十分重要，而且对生物制品的应用也有重要意义。如白喉抗毒素、破伤风抗毒素经胃蛋白酶酶解后精制提纯的制品，因去掉Fc段而减少超敏反应的发生。,四、免疫球蛋白的抗原性或异质性,免疫球蛋白异质性表现为：不同抗原表位刺激所产生的抗体分子，其结合抗原的特异性不同；同一抗原表位刺激所产生的抗体分子，其结合抗原的特异性相同；但恒定区不同。抗体可变区的异质性抗体恒定区的异质性：类、亚类、型、亚型外源因素引起的异质性Ig的多样性内源因素引起的异质性Ig的血清型 同种型、同种异型、独特型,免疫球蛋白的抗原性,同种型(isotype)
9、：是同一种属所有个体的免疫球蛋白分子所共有的抗原特异性。同种异型(allotype)：是同一种属的不同个体间的免疫球蛋白分子所具有的不同的抗原特异性。独特型：同一个体内的免疫球蛋白分子可变区的抗原特异性各不相同，其超变区各自具备独特的抗原表位结构，称为抗体的独特型(idiotype, Id)。,四、免疫球蛋白的抗原性,抗独特型抗体：独特型可刺激异种、同种异体以及自体产生的抗体为抗独特型抗体（Anti-idiotype antibody,AId）意义：独特型-抗独特型网络机体免疫调节的主要方式之一。,五、各类Ig的特点,单体结构 含量高，占血清Ig总量的75-80，其中IgG1含量最多 半衰期约
10、最长：20-23天，再次免疫应答产生的主要抗体，其亲和力高，分布广 中和毒素、调理吞噬、激活补体，是抗感染的主要抗体 唯一能通过胎盘的Ig（ IgG13）新生儿抗感染免疫 能与葡萄球菌胞壁上的A蛋白(SPA)结合纯化抗体、免疫诊断,IgG,IgM五聚体, 单体：膜结合型构成BCR 五聚体：分泌型巨球蛋白 IgM分子量大，不易透出血管，对防止菌血症、败血症的发生具有强大的作用。 有较多结合价，是高效能的抗体，其杀菌、溶菌、溶血、促吞噬以及凝集作用比IgG高500倍1000倍。 产生最早（个体发育中最早合成，初次体液免疫应答中最早产生）,半衰期较短(5天左右) ，故IgM既是宫内感染的指标，又是传
11、染病早期诊断的指标。,IgA,1、血清型IgA 占血清Ig总量的10152、分泌型IgA（SIgA） 结构: J链连接的双体和分泌片 分布: 胃肠道和支气管分泌液、乳汁（初乳中含量最高）、唾液、泪液中 功能: 对机体的局部粘膜(如呼吸道、消化道粘膜)的抗感染免疫有重要作用。 新生儿通过母乳喂养，可获得被动免疫。,IgD单体结构；血清含量低，占Ig总量的0.2；半衰期极短，仅3天（铰链区长） B细胞表面的IgD（SmIgD）是成熟B细胞的重要表面标志：未成熟B细胞仅表达mIgM，成熟B细胞（初始型）表达mIgM和mIgD，活化或记忆性B细胞mIgD逐渐消失。,单体结构 含量最低，约占Ig总量的0
12、.002% 黏膜下淋巴组织中的浆细胞产生 与I型超敏反应密切相关 FcRI 为高亲和力受体，主要分布在肥大细胞和嗜碱性粒细胞膜上。,IgE,六、免疫球蛋白的生物学功能,特异性结合抗原激活补体结合细胞通过胎盘和黏膜具有抗原性,六、免疫球蛋白的生物学功能,V区功能,Ig通过V区识别并特异性结合抗原，发挥免疫效应。 结合抗原的效价 IgG、IgE、IgD：双价 IgA：4价 IgM：理论上10价，实际上5价。介导免疫效应：中和毒素，阻止病原体感染、作为抗原受体识别抗原等。,C区的功能,1、激活补体 IgG13、IgM经典途径 IgA、IgE、IgG4聚合物旁路途径2、结合细胞表面的Fc受体（FcR）
13、 调理作用：指抗体、补体促进吞噬细胞吞噬细菌等颗粒性抗原的作用。 如IgG与巨噬细胞、中性粒细胞, 发挥抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody dependent cell-mdeiated cytotoxicity, ADCC)：指具有杀伤活性的细胞如NK细胞通过其表面表达的Fc受体识别结合于靶抗原（如病毒感染细胞或肿瘤细胞）上的抗体Fc段，直接杀伤靶细胞。 NK细胞是介导ADCC的主要细胞。抗体与抗原的结合是特异性的，而ADCC杀伤作用是非特异性的。 介导I型超敏反应：IgE,3、穿过胎盘和粘膜： IgG是唯一能穿过人胎盘屏障的免疫球蛋白，对新生儿的免疫具有重要作用。 IgG 通过
14、结合母体侧滋养层细胞表面的FcRn，主动转移到胎儿血循环。 分泌型IgA与粘膜免疫,Ig基因由三组不连锁的基因群控制，即轻链基因群（2号）、轻链基因群（22号）和重链基因群（14号）基因重排（ gene rearrangement）在B细胞发育过程中，一部分基因片段互相接近，重新排列，形成功能性的Ig基因单位的过程。,七、免疫球蛋白基因,七、免疫球蛋白基因,表：人胚系基因中Ig基因定位与片段,注：括号中为除假基因及无效基因之外的功能基因片段数,基因重排V/D/J/C基因群中各选择一个片段，组成单个Ig的编码基因，再转录翻译成功能性Ig。Ig基因重排：胚系B细胞 VH基因(D-J V-DJ)重排
15、 轻链基因(V/J)重排（先是k，重组失败，基因重排） VDJ或VJ基因与C基因连接，形成mRNA 翻译为重链和轻链 以二硫键组合成Ig,七、免疫球蛋白基因,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1987for his discovery of the genetic principle for generation of antibody diversity,Susumu Tonegawa（利川根进）,七、免疫球蛋白基因,七、免疫球蛋白基因：基因重排,重组信号序列 (recombination signal sequence，RSS)是由寡核苷酸
16、组成的七聚体(heptamer) 5CACAGTG3、九聚体(nonamer) 5ACAAAAACC3，以及两者之间较少保守性的间隔序列(spacer)所组成。间隔序列的碱基数为12或23，在重组酶的识别和作用下，带有12bp间隔序列的RSS基因片段只能和带有23bp间隔序列的基因片段结合，保证了基因片段的正确连接，该现象称为“12-23规则”。,七、免疫球蛋白基因,Ig的基因重排信号序列,七、免疫球蛋白基因：基因重排,重组酶 (recombinase)是一组参与V、(D)、J基因片段重组的酶。重组激活基因(recombination activating gene，RAG)编码重组激活酶，有
17、RAG-1和RAG-2两种，形成的复合物是一种内切酶，可特异性识别并切除 V、(D)、J基因片段两侧RSS的保守序列。末端脱氧核苷酸转移酶 (terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)表达于B细胞前体，可将数个核苷酸（N-核苷酸）通过一种非模板编码(non-template encoded)的方式加到DNA的断端。其他 还有切开发夹结构的内切酶，参与修复DNA双链断端的DNA外切酶、DNA合成酶等。,七、免疫球蛋白基因：基因重排,VDJ 基因重组的结果：促进免疫球蛋白基因的转录,七、免疫球蛋白基因：类别转换, 缺失模型 RNA的可变剪接,七、免疫球蛋白
18、基因,七、免疫球蛋白基因,膜表面Ig（SmIg）和分泌型Ig的基因重排SmIg和分泌性Ig的H链结构相类似，所不同的是SmIg的羧基端多含一段穿膜的疏水性氨基酸残基和胞浆区。因此SmIgH链的转录本（transcript）要比分泌性IgH链转录本多12个外显子。膜型和分泌型Ig重链基因的结构和重排相同，但在RNA水平上的剪接有所不同。,七、免疫球蛋白基因,等位基因排斥现象：早期成熟B细胞只表达Ig两个等位基因中的一个。轻链同种型排斥：每个B细胞合成两型轻链中的一种。,* 组合多样性* 连接多样性* 体细胞高频突变（B细胞）,Ig 多样性的机制,1. 组合多样性：V/D/J/ 的组合及轻重链的组
19、合 肽链 组合多样性 连接多样性 VH VH65 x DH30 x JH6=11700 Vk Vk50 x Jk5 =250 Vl Vl30 x Jl4 = 120 L 250+120 = 370 H+L 2.5 x 108 3 x 107 总计 1014,组合多样性,2. 连接多样性：发生于胚系基因 CDR3区位于V/J或V/D/J片段连接处，两个片段之间的连接点不同或丢失或插入数个核苷酸及倒转。3. 体细胞高频突变造成的多样性： 成熟B细胞在受到抗原刺激后，在生发中心发生体细胞高频突变，多发生在Ig的CDR区，若干核苷酸替换突变，利于提高抗体与抗原的亲和力。,七、免疫球蛋白基因,免疫球蛋白
20、的多样性 连接多样性: P-核苷酸插入 N-核苷酸插入,Junctional diversity,Junctional diversity,Somatic hypermutation,八、人工制备抗体,多克隆抗体（polyclonal antibody）单克隆抗体（monoclonal antibody）基因工程抗体（gen engineering Ab）,八、人工制备抗体,多克隆抗体（polyclonal antibody）用含多种抗原决定簇的抗原物质免疫动物，刺激多个B细胞克隆所获得的免疫血清（含多种抗体的混合物），此为多克隆抗体。来源广泛，制备容易；特异性不高，易产生交叉反应,带有多个表
21、位,针对不同表位的B细胞,克隆增殖,多种抗体的混合物（多克隆抗体）,刺激小鼠,八、人工制备抗体,单克隆抗体单个B细胞克隆增殖产生的只针对某一特定抗原决定基的抗体称为单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb），单克隆抗体通过杂交瘤技术制备所制备的高度均一（属同一类、亚类、型别），单一特异性（仅针对特定抗 原表位）的抗体，可大量生产。鼠源单克隆抗体可诱导人体产生人抗鼠抗体,Georeges Kohler and Cesar Milstein, 1984, monoclonal antibody,HAT: 次黄嘌呤(H),氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T) HGPRT：次黄嘌呤鸟嘌
22、呤磷酸核糖转化酶,八、人工制备抗体,基因工程抗体 借助DNA重组技术和蛋白质工程技术，按人们的意愿在基因水平上对Ig进行切割、拼接或修饰，重新组装成为新型抗体分子.,八、人工制备抗体,基因工程抗体嵌合抗体 (chimeric Ab) 小鼠V区基因 + 人C区基因 载体 表达人源化抗体(humanized Ab)即 CDR移植抗体(CDR-grafted Ab) 小鼠CDR基因 人V区框架,八、人工制备抗体,小分子抗体 由Fab和Fv组成的抗体片段，包括Fab单域抗体（ VH和CH1 ），Fv （VH和VL ），单链抗体（ VH-Linker-VL ）,分别构建载体,L链表达载体,H链表达载体,
23、共转染细胞,Pr VH Pr VL,Fv 二硫键稳定的Fv (disulfide-stabilized Fv,ds-Fv)小分子抗体的制备,ds-Fv,VH VL,接头DNA (Gly4Ser)3,VH引物,PCR,VH 接头DNA,酶切、克隆,ScFv (single chain Fv,scFv )的构建,变性、复性,VL引物,Sc-Fv,VL,双特异性抗体,抗原A,抗原B,-S-S-,Fab,VL,-S-S-,CH1,VH,VL,Fv,VH,VL,CTL,CD3,TUMORCELL,-S-S-,抗原A,抗原B,Wolf E,Hofmeister H,Kufer P,et al.BiTEs:
24、 bispecific antibody constructswith unique anti-tumor activity. Drug Discover Today.2005,10(18):1237-1244,八、人工制备抗体,噬菌体抗体(phage antibody)是将克隆的人Ab V区基因与丝状噬菌体DNA上的基因或精确相连，转染细菌后在其膜表面表达Fab-噬菌体外壳蛋白的融合蛋白。其优点是： 1.可以不用免疫而直接获取人源性抗体 2.筛选范围大 3.快速,噬菌体展示技术（phage display) 用丝状噬菌体（M13或Fd）：（1）编码外壳蛋白III基因处插入外来基因，采用噬菌体展示技术表达。（2）通过吸附-洗脱-扩增富集性选择过程。转入基因的M13 抗原包被的固相载体 洗涤（去掉不表达特异Ab 的M13） 洗脱 扩增,吸附,抗体库的富集筛选,优点：与杂交瘤技术制备单克隆抗体相比1.可以不用免疫而直接获取人源性抗体 人淋巴细胞mRNAcDNAPCR扩增H/L链基因 克隆到丝状噬菌体2.筛选范围大3.快速,抗体库的构建,八、人工制备抗体,转基因鼠(xenomouse)产生人单抗将编码人Ig基因片段转到自身Ig位点己灭活的小鼠基因组中,使转基因鼠产生高亲和力的人抗体。,九、抗体的应用,科学研究诊断预防治疗,
