1、1,第四节微生物的代谢调节与发酵生产,微 生物细胞内有一整套可塑性极强和极精确的代谢调节系统，以保证上千种酶能正确无误、 有条不紊地进行极其复杂的新陈代谢反应。从细胞水平看，微生物的代谢调节能力要超过复杂的高等动植物。微生物细胞体积极小，而分布及生活的环境条件却复杂 多变，每个细胞要在不同的环境下生存并发展，就必须具备一整套发达的代谢调节系统。参与微生物代谢调节的酶系有上千种，每种微生物的遗传物质中含有合成各 种酶的基因，但这些基因并不同时表达。其中一部分属初级代谢所需，经常以较高浓度存在的为组成酶，其余部分属于诱导酶。只有当某种底物或诱导物存在时，诱 导酶才合成。诱导酶约占总酶量的 10%2
2、0%，组成型酶占总酶量的80%90%。通过代谢调节，微生物能经济、合理和高效利用提供给它的碳源、能源及其他营养物质，合成能满足自己生 长、繁殖所需的各种生物物质，作到“按需合成”，不浪费营养物质和能源。-微生物细胞内的代谢调节主要通过酶合成量、酶活性及细胞膜透性的控制实现,2,一、酶活性的调节,通过改变酶分子的活性来调节代谢速度的调节方式称为酶活性的调节。是酶分子水平上的调节，属于精细的调节。调节效果迅速而灵敏。通过酶活性调节，微生物能迅速适应代谢环境的突然变化。 （一）调节方式：包括两个方面：1、酶活性的激活：在代谢途径中后面的反应可被较前面的反应产物所促进的现象；常见于分解代谢途径。 如：
3、粗糙脉孢霉的异柠檬酸脱氢酶的活性受柠檬酸促进2、酶活性的抑制：包括：竞争性抑制和反馈抑制。概念：反馈：指反应链中某些中间代谢产物或终产物对该途径关键酶活性的影响。即产物对酶的影响称为反馈。 凡使反应速度加快的称正反馈； 凡使反应速度减慢的称负反馈（反馈抑制）； 反馈抑制主要表现在某代谢途径的末端产物过量时可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活性，促使整个反应减慢或停止，从而避免了末端产物的过多累积。 主要表现在氨基酸、核苷酸合成途径中。特点：作用直接、效果快速、末端产物浓度降低时又可解除抑制。,3,直线式代谢途径中的反馈抑制分支代谢途径中的反馈抑制同工酶调节协同反馈抑制 合作反馈抑制 累积反馈抑
4、制顺序反馈抑制,（二）反馈抑制的类型,4,1.直线式代谢途径中的反馈抑制：直线代谢途径的反馈抑制较为简单,A B C D E,反馈抑制,苏氨酸脱氨酶苏氨酸-酮丁酸异亮氨酸反馈抑制其它实例：谷氨酸棒杆菌的精氨酸合成2.分支代谢途径中的反馈抑制：在分支代谢途径中，反馈抑制的情况较为复杂，为了避免在一个分支上的产物过多时不致同时影响另一分支上产物的供应，微生物发展出多种调节方式。主要有： 同功酶的调节， 顺序反馈，协同反馈，合作反馈，积累反馈调节等。,反馈阻遏,5,（1）同功酶调节isoenzyme,同功酶又称同工酶，指能催化同一生化反应，但酶蛋白分子结构不同的一类酶。同功酶主要用于代谢调节。在1个
5、分支代谢途径中，如果分支点以 前的一个反应是由几个同功酶催化，则分支代谢的几个最终产物往往分别对这几个同功酶发生抑制作用。如图中AB的反应由3个同功酶a、b、c催 化，它们分别受最终产物E、H、G抑制，某一终产物过量时仅能抑制相应同功酶的活性，而不影响其他几种终产物的合成。,6,（2）协同反馈抑制,定义：分支代谢途径中几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方式。举例：谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）天冬氨酸族氨基酸合成中天冬氨酸激酶受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制和阻遏。,7,（3）合
6、作反馈抑制,也称增效反馈抑制，指两种终产物同时存在时的反馈抑制效果远大于一种终产物过量时的反馈抑制作用(见图)。合作反馈抑制与协同反馈抑制相似，其特点是每个终产物都能独立地发挥较弱的反馈抑制作用。当其中1种终产物过量合成时，就会立即控制超量终产物分支点后的代谢。当所有终产物都过量合成时，才共同作用以增强抑制效果。,8,（4）累积反馈抑制cumulative feedback inhibition,定义：每一分支途径末端产物按一定百分比单独抑制共同途径中前面的酶，当几种末端产物共同存在时，它们的抑制作用是积累的，各末端产物之间既无协同效应，亦无拮抗作用。,终产物E、G分别抑制总酶活的20%、50
7、%，E、G同时存在时的抑制率为20%+(100-20)50%=60%,9,（5）顺序反馈抑制sequential feedback inhibition,在分支代谢途径中，按一定顺序逐步进行的反馈抑制称为顺序反馈抑制。在下图中，E过量可抑制CD，导致C浓度增高，促使反应向CFG方向进行，又造成另 一终产物G浓度升高；G过量时抑制CF，导致C浓度升高，进一步抑制AB转化。,10,上述反馈抑制的共同之处表现为终产物对反应途径第1酶活性的抑制。酶活性调节的机理可用变构理论解释。,变构酶理论 ：该理论认为，酶是具有一定立体构型的蛋白质，变构酶是一种变构蛋白，具有两个或两个以上的立体专一性不同的接受部位
8、，其中之一与底物结合并具有催化活性，称为活性中心；另一部位可与效应物(代谢终产物等)结合的变构部位，称为调节中心。效应物的结合改变酶的立体构象，并导致酶活性的变化。,（三） 反馈抑制的机制,11,代谢的人工控制及其在发酵工业中的应用,工业发酵的目的：大量积累人们所需要的微生物代谢产物。代谢的人工控制：人为地打破微生物的代谢控制体系，使代谢朝着人们希望的方向进行。人工控制代谢的手段： 改变微生物遗传特性(遗传学方法）； 控制发酵条件（生物化学方法）； 改变细胞膜透性；,12,工业发酵的目的大量地积累人们所需要的微生物代谢产物。,在正常生理条件下,微生物通过其代谢调节系统最经济地吸收利用营养物质用
9、于合成细胞结构，进行生长和繁殖，它们通常不浪费原料和能量，也不积累中间代谢产物,代谢的人工控制,人为地打破微生物的代谢控制体系，就有可能使代谢朝着人们希望的方向进行,13,（1）对于直线式代谢途径：选育营养缺陷型突变株只能积累中间代谢产物 A a B b C c D d E,营养缺陷型菌株的应用,末端产物E对菌体生长乃是必需的，所以，应在培养基中限量供给E，使之足以维持菌株生长，但又不至于造成反馈调节（阻遏或抑制），这样才能有利于菌株积累中间产物C 。,遗传学方法,14,(2) 分支代谢途径：情况较复杂，可利用营养缺陷型克服协同或累加反馈抑制积累末端产物，亦可利用双重缺陷发酵生产中间产物,15
10、,各图成立的条件：1. 限量添加E；2.限量添加E；3.限量添加E和G；4.限量添加E和G；5.限量添加I,“”表示营养缺陷突变位置；“”表示反馈调节解除,要根据其不同反馈控制机制,16,谷氨酸棒杆菌的代谢调节与赖氨酸生产 E：表示反馈抑制；R：表示反馈阻遏,高丝氨酸脱氢酶（HSDH）,天冬氨酸激酶（AK),赖氨酸生产菌:,高丝氨酸缺陷型,17,分支途径赖氨酸发酵:谷氨酸棒杆菌的Hom,18,分支途径肌苷酸发酵（IMP合成途径的代谢调控）,调控理论的实践应用,19,青霉素合成受赖氨酸抑制，共同前体：,20,再见,21,22,23,24,25,4.3.1.2抗反馈控制突变株的应用,抗反馈控制突变
11、株是指对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性，或两者兼有之的菌株。抗反馈控制突变株可以从终产物结构类似物抗性突变株和营养缺陷性回复突变株中获得。获得方法及其原理：,26,27,营养缺陷型回复突变株,调节酶的变构特性是由其结构基因决定的，如果调节酶的基因发生突变而失活，则有两种可能性：,一是催化亚基和调节亚基的基因均发生突变；,另一种可能仅仅是催化亚基发生突变。,一是催化亚基和调节亚基恢复到第一次突变前的活性水平。,如果前者发生回复突变，则又有两种可能性,另一种是催化亚基得以恢复，而调节亚基丧失了调节的功能。,营养缺陷型回复突变,28,4.3.1.3选育组成型突变株和超产突变株,如果调节基因发生突变，以
12、至产生无效的阻遏物而不能和操纵基因结合，或操纵基因突变，从而造成结构基因不受控制的转录，酶 的生成将不再需要诱导剂或不再被末端产物或分解代谢物阻遏，这样的突变株称为 组成型突变株。少数情况下，组成型突变株可产生大量的、比亲本高的多的酶，这种突变株称为超产突变株。,29,组成型突变株,结构基因不受控制地转录，酶的生成将不再需要诱导剂或不再被末端产物或分解代谢物阻遏。,调节基因发生突变,产生无效的阻遏物而不能与操纵基因结合,操纵基因突变,突变操纵基因不能与阻遏物结合,组成型突变,30,DA B C E F,4.3.2生物化学方法,1. 添加前体绕过反馈控制点：亦能使某种代谢产物大量产生,(-),(
13、-),(-),2. 添加诱导剂：从提高诱导酶合成量来说，最好的诱导剂往往不是该酶的底物，而是底物的衍生物，3. 发酵与分离过程耦合：4. 控制发酵的培养基成分：,31,4.3.2控制细胞膜渗透性,使胞内的代谢产物迅速渗漏出去,解除末端产物的反馈抑制。 (1). 用生理学手段 直接抑制膜的合成或使膜受缺损 如: 在Glu发酵中把生物素浓度控制在亚适量可大量分泌Glu；控制生物素的含量可改变细胞膜的成分，进而改变膜透性；当培养液中生物素含量较高时采用适量添加青霉素的方法；再如：产氨短杆菌的核苷酸发酵中控制因素是Mn2+； Mn2+的作用与生物素相似。(2). 利用膜缺损突变株 油酸缺陷型、甘油缺陷
14、型如:用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型，培养过程中，有限制地添加油酸，合成有缺损的膜，使细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸产量。甘油缺陷型菌株的细胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸大量渗漏。应用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或油酸过量的情况下，也可以获得大量谷氨酸。,32,控制细胞膜的通透性,生物素是脂肪酸生物合成中乙酰CoA羧化酶的辅基，该酶催化乙酰CoA的羧化生成丙二酸单酰CoA，进而合成细胞膜磷脂的主要成分脂肪酸,只要控制生物素的含量就可以改变细胞膜的成分，进而改变膜的通透性，影响到代谢产物的分泌。,甘油缺陷型菌株,添加适量的青霉素,油酸缺陷型菌株,33,5、微生物次级代谢与次级代谢产物,5.1
15、、次级代谢与次级代谢产物,一类与生物生存有关的、涉及到产能代谢和耗能代谢的代谢类型，普遍存在于一切生物中。,初级代谢：,微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动所必需的物质和能量的过程，称为初级代谢。,某些生物为了避免在初级代谢过程某种中间产物积累所造成的不利作用而产生的一类有利于生存的代谢类型。可以认为是某些生物在一定条件下通过突变获得的一种适应生存的方式。通过次级代谢合成的产物通常称为次级代谢产物，大多是分子结构比较复杂的化合物。根据其作用，可将其分为抗生素、激素、生物碱、毒素及维生素等类型。,次级代谢：,34,初级代谢与初级代谢的关系：,初级代谢系统、代谢途
16、径和初级代谢产物在各类生物中基本相同。它是一类普遍存在于各类生物中的一种基本代谢类型。,(1)存在范围及产物类型不同,象病毒这类非细胞生物虽然不具备完整的初级代谢系统，但它们仍具有部分的初级代谢系统和具有利用宿主代谢系统完成本身的初级代谢过程的能力。,次级代谢只存在于某些生物（如植物和某些微生物）中，并且代谢途径和代谢产物因生物不同而不同，就是同种生物也会由于培养条件不同而产生不同的次级代谢产物。,35,例如某些青霉、芽孢杆菌和黑曲霉在一定的条件下可以分别合成青霉素、杆菌肽和柠檬酸等次级代谢产物。,不同的微生物可产生不同的初级代谢产物,相同的微生物在不同条件下产生不同的初级代谢产物,用于青霉菌
17、的二种培养基：,Raulin培养基：葡萄糖5%、酒石酸0.27%、酒石酸铵0.27%、磷酸氢二铵0.04%、硫酸镁0.027%硫酸铵0.017%、硫酸锌0.005%、硫酸亚铁0.005%,CzapekDox培养基：葡萄糖5%、硝酸纳0.2%、磷酸氢二钾0.1%、氯化钾0.05%、硫酸镁0.05%、硫酸亚铁0.001%,灰黄青素在CzapekDox培养基上培养时可以合成灰黄霉素，在Raulin培养基上培养时则合成褐菌素（fulvic acid）；,Penicillium urticae在含有0.510-8M的锌离子的CzapekDox培养基里培养时合成的主要次级代谢产物是6-氨基水杨酸，但在含0
18、.510-6M的锌离子的CzapekDox培养基里培养时不合成6-氨基水杨酸，但可以合成大量的龙胆醇、甲基醌醇和棒曲霉素。,产黄青霉在在Raulin中培养时可以合成青霉酸。但在CzapekDox中培养则不产青霉酸。,次级代谢产物虽然也是从少数几种初级代谢过程中产生的中间体或代谢产物衍生而来，但它的骨架碳原子的数量和排列上的微小变化，如氧、氮、氯、硫等元素的加入，或在产物氧化水平上的微小变化都可以导致产生各种各样的次级代谢产物，并且每种类型的次级代谢产物往往是一群化学结构非常相似的不同成分的混合物。例如，目前已知的新霉素有4种，杆菌肽、多粘菌素分别有有10多种，而放线菌素有20多种等。,36,初
19、级代谢与初级代谢的关系：,1、存在范围及产物类型不同,2、对产生者自身的重要性不同,初级代谢产物，如单糖或单糖衍生物、核苷酸、脂肪酸等单体以及由它们组成的各种大分子聚合物，蛋白质、核酸、多糖、脂类等通常都是机体生存必不可少的物质，只要在这些物质的合成过程的某个环节上发生障碍，轻则引起生长停止、重则导致机体发生突变或死亡。次级代谢产物对于产生者本身来说，不是机体生存所必需的物质，即使在次级代谢的某个环节上发生障碍。不会导致机体生长的停止或死亡，至多只是影响机体合成某种次级代谢产物的能力。,次级代谢产物一般对产生者自身的生命活动无明确功能，不是机体生长与繁殖所必需的物质，也有人把超出生理需求的过量
20、初级代谢产物也看作是次级代谢产物。次级代谢产物通常都分泌到胞外，有些与机体的分化有一定的关系，并在同其它生物的生存竞争中起着重要的作用。许多次级代谢产物通常对人类和国民经济的发展有重大影响。,37,初级代谢与初级代谢的关系：,(1)、存在范围及产物类型不同,(2)、对产生者自身的重要性不同,(3)、同微生物生长过程的关系明显不同,初级代谢自始至终存在于一切生活的机体中，同机体的生长过程呈平行关系；次级代谢则是在机体生长的一定时期内（通常是微生物的对数生长期末期或稳定期）产生的，它与机体的生长不呈平行关系，一般可明显地表现为机体的生长期和次级代谢产物形成期二个不同的时期。,38,初级代谢与初级代
21、谢的关系：,(1)、存在范围及产物类型不同,(2)、对产生者自身的重要性不同,(3)、同微生物生长过程的关系明显不同,(4)、对环境条件变化的敏感性或遗传稳定性上明显不同,初级代谢产物对环境条件的变化敏感性小（即遗传稳定性大），而次级代谢产物对环境条件变化很敏感，其产物的合成往往因环境条件变化而停止。,39,初级代谢与初级代谢的关系：,1、存在范围及产物类型不同,2、对产生者自身的重要性不同,3、同微生物生长过程的关系明显不同,4、对环境条件变化的敏感性或遗传稳定性上明显不同,(5)、相关酶的专一性不同,相对来说催化初级代谢产物合成的酶专一性强，催化次级代谢产物合成的某些酶专一性不强，因此在某
22、种次级代谢产物合成的培养基中加入不同的前体物时，往往可以导致机体合成不同类型的次级代谢产物，,另外，催化次级代谢产物合成的酶往往是一些诱导酶，它们是在产生菌对数生长末期或稳定生长期里，由于某种中间代谢产物积累而诱导机体合成的一种能催化次级代谢产物合成的酶，这些酶通常因环境条件变化而不能合成。,40,初级代谢与初级代谢的关系：,(1)、存在范围及产物类型不同,(2)、对产生者自身的重要性不同,(3)、同微生物生长过程的关系明显不同,(4)、对环境条件变化的敏感性或遗传稳定性上明显不同,(5)、相关酶的专一性不同,(6)某些机体内存在的二种既有联系又有区别的代谢类型,初级代谢是次级代谢的基础，它可以为次级代谢产物合成提供前体物和所需要的能量；初级代谢产物合成中的关键性中间体也是次级代谢产物合成中的重要中间体物质。而次级代谢则是初级代谢在特定条件下的继续与发展，避免初级代谢过程中某种（或某些）中间体或产物过量积累对机体产生的毒害作用。,41,
