1、课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与记数,1、了解尿素 尿素是一种由C、H、O、N组成的有机化合物，分子式为CO(NH2)2，它是动物体内蛋白质代谢的产物，在肝脏中合成后，随尿液排出。 1828年，德国化学家维勒成功通过无机物的化学反应合成了尿素。此后，尿素走向工业化并广泛用于农业生产。,课题背景,课题背景,尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的某些细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、尿素的利用,3、细菌能分解尿素的原因,直接原因：能合成脲酶（分解尿素的酶）根本原因：具有合成脲酶相关的基因,两个主要目的：（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
2、。,课题目的,科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶,说明：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,筛选原因：因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，使耐热的Taq细菌保留下来。,DNA多聚酶链式反应(PCR)是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。1966年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的Taq细菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶。,一、筛选菌株,耐高温的酶,耐高温生物体,耐高温环境（热泉、火山口）,寻找,寻找,2、方法：,实验室如何筛选菌种,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时
3、抑制或阻止其他微生物生长。,1、原理：,使用选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,根据原理， 培养基应如何配制，才能将分解尿素的细菌分离出来？,利用以尿素为唯一氮源的培养基进行筛选,1、显微镜直接计数：,利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,.统计菌株数目：统计每克土壤样品中究竟含有多少细菌,不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点,2.间接计数法（活菌计数法）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。,平板划
4、线法得到的菌落 稀释涂布平板法得到的菌落,使用稀释涂布平板法接种，在稀释度足够高的培养基中，细菌比较分散，容易形成单个菌落。 一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌,间接计数法（活菌计数法）,统计菌落数目,每克样品中的菌株数=（CV)M C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V:所用稀释液的体积；M:稀释倍数。,注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。,稀释度是不是越高越好？,如果稀释度过高，菌落数少于30，计算结果偏低，误差大；如果稀释度过低，菌落数超过300，统计和计算结果都会有误差；,恰当的稀释度是成功统计菌落数目的关键。,两位同学用稀释涂布平板法测定同一
5、土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？,甲：没有重复实验（至少涂布3个平板） 乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。,资料分析：,注意事项为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要涂布至少三个平板作为重复组。分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误
6、，需重新实验。为防止培养时间不足导致菌落遗漏，在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数，选取菌落数稳定时的记录作为结果。统计的菌落数往往比活菌实际数目低。,因为当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落,计数法,直接计数法、平板计数法、比浊法、膜过滤法,三、设置对照,1、目的： 排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 对照实验是指除了 被测试 的条件外，其他条件都 相同 的实验。,利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为106的培养基中，A、B两同学分别得到以下两种统计结果。 1、A同学筛选出150个菌落。 2、B同学筛选出50个菌落。 B认为
7、A的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。A确认自己的操作无误，不同的原因是自己所用的土壤样品与其他同学不同，但由于自己在实验时未设置对照，因此也拿不出能令人信服的证据。请你帮助A同学改进实验，提供具有说明了的证据。,资料分析：,小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明是土样不同引起；如果结果不同，则证明A同学的操作有误。
8、,土样不同,操作有误导致培养基被污染,二.实验的具体操作 .土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。.制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。,应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板,三样品的稀释,为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？,原因：土壤中各
9、类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,.取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,.微生物的培养与观察,培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：3037培养12d放线菌：2528培养57d霉菌：2528的温度下培养34d。,微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生物都是能分解尿素的微生物吗？,思考：,不一定。因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。,课题延伸：鉴定菌株,原理：产脲酶的细菌将尿素分解成氨，培养基PH会升高，通过检测培养基PH变化来判断该化学反应是否发生。,方法：在以尿素作为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养该细菌，如果 PH升高，指示剂变红，可以初步鉴定该种菌能分解尿素。,
