1、菠萝蛋白酶提取纯化及化学修饰对其活性的影响一、实验目的1、掌握菠萝蛋白酶的提取和纯化方法2、研究菠萝蛋白酶的稳定性3、掌握菠萝蛋白酶的化学修饰并对修饰酶与未修饰酶的活性比较二、实验原理菠萝蛋白酶（Bromelain,EC 3.4.22.3）是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶。菠萝蛋白酶属于糖蛋白，分子量约为 33000D，等电点为 9.55，白色至浅棕黄色无定形粉末，溶于水。水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白酶，能分解蛋白质，肽，酯，酰胺。它的水解蛋白的活性比木瓜蛋白酶的活性高十倍以上，因此有着广泛的用途。它作为一种食品
2、添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清，还用于干酪、明胶、水解蛋白酶的生产。在医药上它可用于生物体内溶解纤维蛋白及血凝块，因此可用于治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。 菠萝蛋白酶的最适温度范围比较稳定，最稳定范围是 5565。菠萝蛋白酶的最适 pH 在 7.1 左右，呈现中性。金属盐离子中 NaCl、KCl 对酶活的影响不是很大，较高浓度的 MgCl2、CaCl 2对菠萝蛋白酶单宁复合物有一定程度的抑制作用，尤其在浓度较高的情况下对菠萝蛋白游离酶酶活的影响更大。Zn 2+的作用中以醋酸锌的作用更为显著，极低的浓度即能促使菠萝蛋白酶的酶活性明显提
3、高。较低浓度的 ZnCl 2也能使酶的稳定性有所提高。维生素 C、半胱氨酸、硫代硫酸钠、2-巯基乙醇是菠萝蛋白酶的稳定剂，都能使酶分子中巯基基团维持还原态，能够作为还原剂来提高酶活力。0.05%的苯甲酸钠即能使氧化脱氢酶的活性得到抑制，对酶起到保护作用。对酶活有影响的金属离子，EDTA 能通过螯合而保护菠萝蛋白酶，消除其对酶的失活作用。其它试剂如 50%的甘油、葡萄糖、 40%的半乳糖都能使菠萝蛋白酶的半衰期延长，蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、松三糖、乙二醇和甘露醇均对菠萝蛋白酶有一定的保护作用。菠萝蛋白酶含有 1 个巯基和 4 个内肽二硫键。在蛋白质中 , SH 部分是与酶活性有关的最具有反应性的官
4、能团，巯基能够和 N 取代马来酰亚胺反生加成反应，可以对巯基进行修饰，验证巯基对酶催化活性的影响 NCOOHOORSH+ NCOOHOORS三、试剂材料1、材料：新鲜的成熟菠萝2、仪器：榨汁机、离心机、紫外分光光度计、恒温水浴锅、氯化钙的干燥器、CM琼脂糖凝胶柱（1.1cm30.0cm）、研钵、滴管（大、小）、烧杯（大、中、小）、试管、具塞试管、白瓷板、温度计、PH计、搅拌棒。3、试剂：0.2%单宁、5%苯甲酸钠溶液、0.1%/0.5%EDTA 溶液、1.5%氯化钠溶液、20mMpH4.0的醋酸缓冲液、1MNaC-20mM pH4.0醋酸缓冲液（含0.01%EDTA）、三氯乙酸溶液、0.1M盐
5、酸、0.1M氢氧化钠、50%乙二醇溶液、50%甘露醇溶液、50%葡萄糖溶液、50%甘油溶液、O.1mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 3.0)、N-乙酸顺丁烯二酰亚胺（NEM） （A.R.）PBS缓冲液：称取KH 2PO42.69g及K 2HPO413.97g，加水溶解后，定容至1000mL即得。酪氨酸溶液：精确称取105 下干燥至恒重的酪氨酸5mg，用pH7.4磷酸缓冲液定容至100ml。酪蛋白溶液：精确称取酪蛋白5mg，用pH7.4磷酸缓冲液定容至100ml。酶激活剂：20mmol/L半胱氨酸盐酸盐，1mmol/LEDTA-Na, 用pH7.4磷酸缓冲液定容至100ml。蛋白酶液：精确称取菠萝
6、蛋白酶 1g，用 pH7.4 磷酸缓冲液定容至 1000ml。四、实验步骤1.菠萝蛋白酶提取纯化1.1. 澄清菠萝汁的制备 将菠萝在清水中洗净，沥干，用压榨机压出汁液。 用四层纱布挤压进行渣汁分离，获得的粗汁液再经四层纱布过滤去除纤维状物质。得到的粗滤液在 4下 3000rpm 离心 10min，留上清液备用。 1.2. 硫酸铵沉淀 取澄清的菠萝皮汁在 4磁力搅拌作用下缓慢加入经过研磨的固体硫酸铵至饱和。当硫酸铵全部加入后要不断搅动 10min，以使溶解的蛋白和聚集的蛋白达到平衡。将此富含酶蛋白的溶液于 5000rpm 离心 5min，收集沉淀并分离出上清液。1.3.透析除硫酸铵 1.3.1
7、透析袋预处理： 将透析袋剪成适当长度，置于含 1mmol/LEDTA 的 2%NaHCO3溶液中，煮沸 10min。用去离子水彻底清洗透析袋后，再用 1mmol/LEDTA 溶液煮沸 10min。冷却后，于 4保存备用。1.3.2 操作步骤： 将商品化的透析袋适当处理后，封住一端，用纯水检查其完整性，然后将上述沉淀用少量缓冲液溶解后，装入透析袋，赶出袋中的空气，封住透析袋的另一端，放进 1000mL 烧杯中，下置电磁力搅拌器缓慢搅拌，4透析过夜，对该缓冲液透析，换液 3-4 次后，用 1%BaCl 2溶液检测 SO 42-是否已被除尽。收集透析内液，离心，用于进一步上柱纯化。1.4.CM Se
8、pharose FF 凝胶柱纯化1.4.1 离子交换介质处理与转型 用初始缓冲液替换倾倒澄清掉 20%乙醇，并用初始缓冲液配成凝胶匀浆（凝胶占 75%，缓冲液占 25%） ，作真空脱气处理备用。 1.4.2.装柱与平衡 打开层析柱顶部，关闭出口，用 20mM pH4.0 的醋酸缓冲液润湿层析柱柱内及柱子底端并保持一小段液位，略高出滤膜，仔细驱除底端气泡。将凝胶匀浆用玻璃棒引导边搅拌边沿着柱内壁按同一方向连续倾倒入柱内，防止空气泡的产生，同时用缓冲液填充柱子的剩余部分。打开柱下口出水口夹子，使凝胶在柱内自由沉降，装上层析柱顶端柱头，连接好洗脱液。打开蠕动泵，调节流速，让缓冲液按一定的流速通过，稳
9、定柱子。用 3-4 倍柱体积的缓冲液平衡柱子，直至流出的平衡液和初始平衡液 pH 相等时表示已达到平衡。1.4.3.加样 略微增大层析柱出口的流速，排除凝胶床表面缓冲液。打开层析柱顶塞，用移液管将透析至无 SO42-的酶蛋白溶液沿管壁从凝胶床表面上数毫米处缓慢流下。打开层析柱出口，让蛋白质样品溶液进入凝胶柱床内，待液面重合时，可用少许起始缓冲液洗柱内壁和床表面，关上层析柱出口。1.4.4.洗脱 加样后用足够量的起始缓冲液淋洗，使未吸附的物质被洗出，并达到充分平衡，在凝胶表面缓慢滴加洗脱液，加至洗脱液表面与柱口形成凸面，加入 1M NaCl-20mM pH4.0 醋酸缓冲液（含 0.01%EDT
10、A）以 1mL/min 流速，开始洗脱，1.4.5.收集 将洗脱液按一定的体积分别收集于试管中，收集各吸收峰洗脱液，然后逐管进行分析，合并活性洗脱峰透析冷冻干燥保存备用。2.酶活性的测定2.1 标准曲线的测定取干燥洁净试管，按如下要求操作加入试剂：0 1 2 3 4 5 6酪氨酸(mL) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3PBS(mL) 5 4.5 4 3.5 3 2.5 2酶激活剂(mL) 1 1 1 1 1 1 137水浴保温 5min蛋白酶液(mL) 1 1 1 1 1 1 137水浴保温 15min三氯醋酸(mL) 5 5 5 5 5 5 537水浴保温 5min于 13000rp
11、m 离心 1min，取上清液，在 721 型分光光度计上以 275nm 波长下测其吸光度值 A，记录数据。然后以标准溶液的浓度为横坐标，紫外吸收值为纵坐标绘制标准曲线待用。2.2 样品酶活性测定取干燥洁净试管，按如下要求操作加入试剂：样品 对照酪蛋白 5mL 酪蛋白 5mL酶激活剂 1mL 酶激活剂 1mL37水浴保温 5min酶液 1mL 三氯醋酸 5mL37水浴保温 15min三氯醋酸 5mL 酶液 1mL37水浴保温 5min于 13000rpm 离心 1min，取上清液，在 721 型分光光度计上以 275nm 波长下测其吸光度值 A，记录数据。酶活力单位定义为：在一定温度和 p H
12、值条件下，每分钟水解酪蛋白释放 1g/ g 酪氨酸的酶量定义为 1 个蛋白酶单位，以 U/ g 表示3.酶稳定性研究在测定所用的酶试剂中分别加入 1 滴 PBS 缓冲液、50%甘油溶液、50%乙二醇溶液、50%甘露醇溶液、50%葡萄糖溶液，55水浴 60min，按 2.2 的实验条件及方法测定酶活性。记录吸光度值 A，计算得到酶活性变化情况。溶液 PBS 缓冲液 50%甘油溶 液 50%乙二醇溶液 50%甘露醇溶液 50%葡萄糖溶液吸光度 A4.酶修饰前后活性比较4.1 修饰酶的制备 60gNEM 溶于 40ml 干燥吡啶，加入 1.01g 琥珀酸酐，60 度保温 2h，在 60 度减压蒸馏除
13、去溶剂。加入苯至残余物溶解，再加 100ml 冷己烷，4 度振荡 2h。过滤，残渣溶于蒸馏水后透析，冻干。将其与菠萝蛋白酶按配比投料，加入 0.1mol/L 柠檬酸缓冲液（PH 3.0） ，4 度反应 4h。产物在 PH4.6 柠檬酸缓冲液中透析，冻干后得 NEM-菠萝蛋白酶（修饰酶） 。 4.2 修饰与未修饰酶的活性比较按 2.2 的实验条件及方法测定酶活性。记录吸光度值 A，计算得到酶活性变化情况。酶溶液 修饰酶 未修饰酶吸光度参考文献：董瑞兰. 菠萝蛋白酶的分离纯化及部分应用性质的研究D. 福建农林大学, 2010. 李淑喜, 黎新明. 菠萝蛋白酶的提取及其在医药中的应用J. 广州化工, 2009, 37(2):52-53. 田国贺, 郭佳宓, 吕团伟,等. 聚乙二醇对菠萝蛋白酶的化学修饰J. 生物技术, 2006, 16(1):35-38.
