1、实验名称(Title of Experimetn)蛋白质的定量测定（Folin-酚试剂法）实验日期(Date of Experiment)XXXX实验地点(Lab No.)XXXX合作者(Partner)XXXX 指导老师(Instructor)XXXX总分(Total Score)教师签名(Signature)批改日期(Date)一、实验预习1.0 实验目的 初步了解各种蛋白质含量测定的常用方法。 掌握 Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及熟悉和掌握实验操作技术。 掌握用 excel 制作标准曲线和通过标准曲线及标准管方法求样品溶液中待测定物质含量。1.1 实验原理1.1.1 总体概述
2、Folin-酚试剂法是经过科学家改进的测定蛋白质含量的方法，Folin 首创这种方法：利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）起蓝色反应。而后，Lowry 对此法进行了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度，灵敏度的范围为： ，故使得实验的精确度大大提高，205g:但同时也存在着干扰物质多、费时、操作严格计时等问题。1.1.2 双缩脲反应在碱性溶液中，双缩脲（ ）能和 作用，发生配位22HNOCH2Cu反应，形成紫色或紫红色的络合物，即为双缩脲反应。由于蛋白质的肽键结构与双缩脲结构相似，故在碱性溶液中，蛋白质的分子中肽键能和碱性铜试剂中的 作用
3、，生成紫红色的蛋白质- 复合物。对于蛋白2Cu 2Cu质的测定来说，这一步是基础，这也是 Folin-酚法的基础原理。1.1.3 Folin-酚显色反应Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐-磷钨酸盐易背酚类化合物还原而呈现蓝色。酪氨酸（Tyr）含有酚羟基，故蛋白质- 复合物含有的酪氨酸或2Cu色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。在一定的浓度范围内，蓝色的深浅与蛋白质的浓度呈线性关系。故可以利用上述两种反应通过分光光度法测定待测样品的蛋白质含量。1.1.4 分光光度法测定样品的蛋白质的含量本实验以上述两个反应原理为基础，再通过设置空白对照组，标准管中设置蛋白标
4、准液的一系列浓度梯度（ ， ， ， ）通过分光光度计测0.2mL.40.6L.8m定吸光度，从而获取标准曲线，样品管通过测定的吸光度值，在标准曲线中找到较为准确对应的含量。1.2 实验材料1.2.1 实验样品血清稀释液（正常人血清稀释 300 倍）1.2.2 实验试剂 200 g/ml 牛血清白蛋白标准液（BSA） ； 碱性硫酸铜溶液 （组成：碱溶液与硫酸铜溶液按 50:1 混合而成， 使用时该溶液必须新鲜配制，当日有效） ； Folin-酚试剂 （配制过程较为复杂）注：此次实验所用的试剂全部已由老师制备好，所以无配制过程，但需知道配制流程，可查阅实验书 P105。1.2.3 实验仪器及器材V
5、-1100 可见光分光光度计；恒温水浴箱；试管 6 支、试管架；加样枪、加样枪架。1.3 实验步骤1.3.1 实验流程1.3.2 实验步骤步骤 操作（1）反应体系设置取 6 只洁净的试管，利用加样枪按要求量取相应量的溶液，混合均匀（各试管的需加入的试剂和量见下表）：空白管 标准管 样品管试剂1 2 3 4 5 6牛血清蛋白质标准液 0 0.2 0.4 0.6 0.8 0样品液 0 0 0 0 0 0.5蒸馏水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.5（2）双缩脲反应每隔一分钟，依次往 1 号试管到 6 号试管中加入 2mL 的碱性硫酸铜溶液，摇匀并记录每支试管的加入硫酸铜时间，室温静置
6、10min溶液混合 滴加碱性硫酸铜 静置 10min加入 Folin-酚试剂水浴 10min 比色测定 绘图取结果（3）Folin-酚反应将静置时间达到 10min 中的试管中，加入 0.20mL 的Folin-酚试剂，快速摇匀（一般在 2s 以内） 。在 40 下水浴加热 10min 钟同样需计时。0C10min 钟后取出冷却至室温。（4）比色测定转动波长旋钮，调制 500.0nm，按“mode”键切换到 T档，分别将 1-6 号试管中混合液放入比色杯中利用 1 号试管为空白，校置 100；调至 A 档，依次测定 2-6 试管的吸光度，并读取数据。重复操作，再读取数据 2 次，并记录。数据表
7、格见表 1（5）绘制标准曲线利用测得的数据，绘制以 值为纵坐标，牛血清清蛋白50A标准液浓度为横坐标的准备曲线，具体绘制利用 excel 制作，结果可见图 2（6）测样品蛋白质含量根据样品管（6 管）的吸光度值，在标准曲线中找到对应的蛋白质浓度，再乘以稀释倍数（300） ，得出每毫升未稀释血清含蛋白质的微克数，即每毫升血清中蛋白质的微克数(mg/ml)。血清蛋白浓度(g/ml) = 样品蛋白质浓度2300参考：正常人血清蛋白浓度范围为 6080 g/L。1.3.3 注意事项试剂要求：实验所需的试剂必须是新鲜配制，不然会存在被空气及其他物质氧化还原的情况，干扰实验的测定。控制时间：Lowry 反
8、应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。严格按照实验步骤的操作，规定的时间是多少就多少。水浴时间也不宜过长。同时，在最后从水浴加热后取出冷却后，需及时的进行比色测定。防止混合液中物质发生系列变化和反应。加入 Folin-酚试剂后，需要马上混合摇匀，防止磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏。干扰物质的影响：凡干扰双缩脲反应的基团，均可干扰 Folin-酚反应。这些物质在所测样品中含量较高时，则需做校正曲线。若所测的样品中含硫酸铵，则需增加碳酸钠氢氧化钠浓度即可显色测定。若样品酸度较高，也需提高碳酸钠氢氧化钠浓度 12 倍，这样即可纠正显色后色浅的弊病。绘制曲线要求：作过原点的直线或光滑连续的曲
9、线，该线表示实验点的平均 变动情况，因此该线不需全部通过各点，但应尽量使未经过线上的实验点均匀分布在曲线或直线两侧。(电脑 Excel 绘图，可以不考虑)操作要按照实验步骤，一步一步来，防止操作问题导致的操作误差的出现等。二、实验记录2.1 实验条件材料及试剂：本次实验的试剂和材料均是实验室配制好的，比例和浓度同实验预习，故不再赘述。实验时间表：总表实验步骤 消耗时间混合溶液 未计时滴加溶液静置 10min加 Folin-酚试剂、水浴 10min室温冷却 27min等待 20min比色测定 6min附表项目时刻表 试管 1 试管 2 试管 3 试管 4 试管 5 试管 6加硫酸铜 842”09
10、 843”20 844”29 845”45 846”55 847”55水浴 852”09 853”20 854”29 855”45 856”55 857”55冷却等待 902”09 903”22 904”29 905”45 906”55 908”00操作技巧：在这一次的实验中，关键的要点在于滴加 Folin-酚试剂的摇匀，必须快速摇匀，保证反应优先进行。振荡试管时，振荡的正确方法是用手腕的力左右摆动，使试管中液体混合均匀且不漏出。最后放入到水浴中加热。在分光比色的时候，测量一次后重新凋零，不能继续测量等。操作失误：全部实验过程中，就出现了一次失误，即在试管 4 加入 Folin-酚试剂，充分摇
11、匀，在放入水浴加热之间，部分液体由于磕碰而溅出。其余操作严格按照要求一步步完成，理论不存在着失误。分析：Folin-酚与液体已经混合均匀并反应，在后面的水浴加热后，只是影响到了整体的试管 4 的反应后得到的溶液量，而不影响颜色的变化及最后的比色测定，故该失误不会对实验产生测定的偏差。2.2 实验现象在滴加硫酸铜溶液后，摇匀，产生较多的黏性气泡且附着在液体表面。液体颜色变化不深。在滴加 Folin-酚试剂水浴加热后，除试管 1 为淡黄色外，其余试管均成不同的蓝色。具体看下图：图一 水浴后各试管的情况图分析：标准液的试管中（2-5）蓝色不断加深，同实际的标准液的含量多少正相关，而试管 6 的颜色不
12、深，在 1-2 试管之间，根据实验原理初步可以判定的是：该样品液的蛋白质含量将不会在 60-80g/L 之间，而是在 0-40g/L。即实验存在一定的问题，详见结果的分析与讨论。2.3 实验原始数据本次实验原始数据是在 500nm 的波长下，各试管混合液的吸光度值，结果见下表 1表 1 500nm 波长吸光度值记录各管吸光度值 50A测定次数2 3 4 5 61 0.353 0.561 0.744 0.938 0.1722 0.350 0.562 0.744 0.938 0.1723 0.351 0.562 0.743 0.938 0.172各管平均值 50A三、结果与讨论3.1 数据处理3.
13、1.1 利用原始数据，可得到各管的平均值：2 管： =（0.353+0.350+0.351）/3=0.3513；50A3 管： =（0.561+0.562+0.562）/3=0.5617；依次得到 4-6 管的吸光度值如下所示：各管吸光度值 50A测定次数2 3 4 5 6各管平均值 50A0.3513 0.5617 0.7437 0.9380 0.17203.1.2 Excel 绘制蛋白质的标准曲线根据用 Excel 绘制标准曲线 PPt 所示步骤，最终得到如下结果：图 2 标准曲线图从图中我们可以看到线性方程： ， 0.6yx20.965R将样品溶液的吸光度(即 y 值)代入方程，可得出样
14、品浓度(即 x 值)；由相关指数值 可看出误差大小。2R0.172.172.27.4/xgmL血清蛋白浓度(g/ml) = 样品蛋白质浓度2300故得血清蛋白浓度为 。6.5/gL3.2 结果由上数据处理可知，最后的待测样品的蛋白质含量为 。而真正的正常人16.5/gL血清蛋白浓度范围为 6080 g/L。因此，存在一定问题，具体分析见 3.3 分析与讨论。3.3 分析与讨论首先，我们回顾了整个操作过程，在整个过程中，我们基本都是按照要求操作，并不存在着明显的操作问题。通过上面水浴加热后的图可以明显看到，结果的确应该在 0-20g/L 之间。同时我们与和我们一样使用试剂的组讨论后发现，他们的结
15、果也是在 10 几左右；同时，很多组测出的结果都偏低，故可以初步判定结果的测量方式上不存在明显问题。其次，回顾全部过程的原理，我们猜测可能存在的造成结果低的情况为：在室温冷却后，实验室没有空余的分光光度计，排队时间应该是全部小组中最长的，基本花去 30 多分钟。而这也导致了最后的显色增强（其具体的显色原因可能为物质间的复杂反应导致）从而使得最后的标准曲线的斜率增大，导致测定的标准的样品液蛋白质含量的下降。即 AB,如图所示：分光光度计的比色杯清晰不干净，存在蒸馏水的稀释，且稀释的总体效果是使样品液的含量测定下降。开始实验的试管清洗的不充分，可能存在部分的杂质，导致显色反应的增强。分光光度计的几个比色杯透明面被碰到，影响到了液体的吸光度，吸光度的下降，使得样品液的测定值偏低。最后，有可能在以后的时间里，可以重新做该实验，从多方面来验证自己的分析。多和老师同学交流，得到较好的结果3.4 复习思考题参考资料来源：生物化学与分子生物学实验技术 王晓华，朱文渊主编1、试述 Folin-酚试剂法的优点？BA 蛋白质含量吸光值样品液吸光值增色反应增强后的标准曲线原本的标准曲线
