1、第一部分 防腐挑战实验调研结果1 实验样品样本要求新鲜，没有被微生物污染，一般每个样本为 300g。2 微生物挑战性实验2.1 实验菌株不同国家、组织、企业对挑战实验选择的测试菌种有一定差异（如表 1） ，国内参照美国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA）推荐的菌种（因其较具代表性，如表 2 所示） ，所以更为恰当。 （注意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，MIC 值不同）表 1 某些国家、组织、企业用于化妆品微生物挑战试验的测试菌株菌株美国(药典)美国(ISP 公司)英国(药典)德国(Henkel 公司)德国(S&M 公司)白假丝酵母 黑曲霉 红色青霉 绿色木霉 绳状青霉 大肠
2、埃希氏菌 镉绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 粪肠球菌 产气肠杆菌 表皮葡萄球菌 日勾维肠杆菌 洋葱假单胞菌 肺炎克雷伯氏菌 恶臭假单胞菌 荧光假单胞菌 表 2 CTFA 化妆品微生物挑战试验的菌株选择种类 菌株 数量金黄色葡萄球菌革兰氏阳性菌表皮葡萄球菌至少选一种肺炎克雷伯氏菌阴沟肠杆菌大肠埃希氏菌变形菌属发酵革兰氏阴性杆菌日勾维肠杆菌至少选两种铜绿假单胞菌洋葱假单胞菌荧光假单胞菌恶臭假单胞菌黄杆菌属非发酵革兰氏阴性杆菌不动杆菌属至少选一种白假丝酵母酵母近平滑假丝酵母至少选一种黑曲霉霉菌黄绿青霉至少选一种产芽孢菌 枯草芽孢杆菌 供选用生产现场分离菌 适当菌株 一种以上2.2 培养基牛肉膏蛋白胨培养
3、基、琼脂培养基2.3 试验用菌液的配置（1）标准悬液的配制1%硫酸 9.9ml 与 1%氯化钡 0.1ml，混合后配制成的悬液浓度为3108cfu/ml，此悬液再做 3 倍稀释。（2）细菌菌悬液的配制实验前将菌株接种到各个培养基斜面上，36 摄氏度恒温培养 48 小时。将已培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（310 8cfu/ml）相同为止；此时的稀释菌液再做 3 倍稀释，即为所需的 1108cfu/ml 的菌悬液，做细菌总数确定细菌数。（3）霉菌菌悬液的配制将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥
4、形瓶中，充分振荡摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的 10 倍稀释，每次的稀释用血球计数板计数，必须 5 个中格的霉菌总数在 190210，落在此范围内的菌悬液为我们所需的 1108cfu/ml 的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。2.4 接种2.4.1 接种方式（1）单菌接种：每种测试菌株单独做一个挑战试验。这种方法的优点是容易了解每种微生物对防腐体系的敏感性，在筛选产品的防腐体系时有较好的参考价值，但工作量大、费时、费工，和产品的实际污染菌情况也有差距（因来自自然界的微生物常常不是单一的种类） 。（2）混合菌接种：西欧、德国等的许多国家和企业多采用这种方式，除了因工作量相对较小外，这种
5、接种方法更能代表污染的状况。2.4.2 接种次数和时间（1）一次接种：只是在试验开始时接种一次，整个试验周期 28 天。 （一次加菌的 28 天微生物挑战实验）（2）多次接种：在试验开始接种一次后（重复加菌的微生物挑战实验）a 法：第 21 天再接种一次，试验周期为 28 天。 （有实验表明，第 21 天接菌和不接菌时，第 28 天时的微生物含量并无显著的差别，评定结果也相同）b 法：每隔两周接种一下，连续三次（即第 1、3、5 周接菌，每两周接菌前分离一次） ，试验周期为 49 天；c 法：每周接种一次，连续 5 次，试验周期为 35 天。 （S&M 公司的资料介绍，采用此种方法评价认可的防
6、腐体系，可保证产品 30 个月内的防腐安全）2.4.3 操作方法称取待测样品 30g，对应加入 0.3ml 浓度为 1107110 8cfu/ml 的细菌悬液及霉菌悬液，用干净的无菌勺子搅拌均匀后盖上保鲜膜，细菌在 32.52.5的培养箱中培养，霉菌在 22.52.5的培养箱中培养。a.水溶性样品10g 加入 90ml 无菌生理盐水，稀释后取 1ml 样品液，加入 9ml 灭菌生理盐水中，做依次稀释，分别为 10-1、10 -2、10 -3、10 -4、10 -5、10 -6、10 -7 等稀释度；取三个合适稀释度的样液，分别吸取 1ml 样液加入已灭菌的平皿中，做菌落计数，并做两个平行。b.
7、油溶性样品取 10g 样品，加入 10ml 无菌吐温-80 和 10ml 无菌白矿油，再加 70ml 无菌生理盐水，用无菌玻棒充分混匀；吸取 1ml 已稀释的样品液，加入 9ml 灭菌生理盐水中，做依次稀释，分别为 10-1、10 -2、10 -3、10 -4、 10-5、10 -6、10 -7 等稀释度；取三个合适稀释度的样液，分别吸取 1ml 加入已灭菌的平皿中，做菌落计数，并做两个平行。2.5 培养细菌放在 32.52.5的培养箱中培养；霉菌在 22.52.5的培养箱中培养；混合菌在 28的培养箱中培养。2.6 菌落计数分别在 0、7、14、21、28 天分离计算样品中活的细菌、霉菌；每
8、次计算完细菌总数、霉菌总数后将平皿放回培养箱，以待下次观察用，观察中切勿打开平皿，以免燃菌而使下次无法观察。菌落计数的标准方法：先选取平均菌落数在 30300 之间的平皿作为细菌菌落总数测定范围，选取平均菌落数在 550 之间的平皿作为霉菌菌落总数测定范围；有两个稀释度在 30300 之间，求比值。若比值2，报告平均数；若比值2，以其中较小的稀释度计算细菌总数；所有稀释度都大于 300，以稀释度最高的平均菌落数计算；所有稀释度都小于 30，以稀释度最低的平均菌落数计算；所有稀释度均在 30300 之外，其中一个大于 300，而相邻的加一稀释度小于 30，则以最接近 30 或 300 的平均菌落
9、数计算；若平皿中有连成片状或花点样菌落蔓延生长时，不宜计算；若片状菌落不到平皿中的一半，而另一半中菌落均匀，则可将此平皿菌落计数后2，以报告全皿菌落数。2.7 评价标准2.7.1 CTFA 推荐的一次加菌防腐挑战性试验及评价标准CTFA 的方法初始的霉菌和细菌的接种量分别为 10000cfu/g（ml）和1000000cfu/g（ml） （CFU 为菌落单位） ，要求在第 7 天时霉菌降低 90%，细菌降低 99.9%，并且在 28 天内菌数持续下降。2.7.2 美国评价标准在 CTFA 评价方法的基础上提出的标准，如表 3 所示。表 3 美国所用一次加菌的微生物防腐挑战实验评价标准评价标准
10、一次加菌的 28 天微生物挑战实验防腐效果优良 若单菌接种的三个平行试验中任何一种微生物数量的平均值，在第七天时下降到 100 cfu/g（ml）以下，第 28 天全部为 0。防腐效果勉强通过 若单菌接种的三个平行试验中任何一种微生物数量的平均值，在第七天时下降到 1000 cfu/g（ml）以下。防腐效果无效 若单菌接种的任何一种微生物，任何一个平行样达不到上述标准，也达不到 CTFA 的要求。2.7.3 国内评价标准国内参照 CTFA 加菌防腐挑战性评价标准。表 4 国内所用微生物防腐挑战实验评价标准评价标准 一次加菌的 28 天微生物挑战实验重复加菌的微生物挑战实验防腐效果优良（W） 第
11、 28 天化妆品中存货的细菌数量100CFU/ml，说明该样品防腐体系对细菌有较差的抑杀效果。在三次加菌后，在每次加菌的第 14 天样品中存货的细菌数1000CFU/ml第二部分 实验室可采取的方案1 实验样品2 微生物挑战性实验2.1 实验菌株金黄葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、白假丝酵母、枯草芽孢杆菌2.2 培养基牛肉膏蛋白胨培养基2.3 试验用菌液的配置实验前，将各菌株接种于合适的培养基中，于 37（细菌）和 28（霉菌）培养箱中培养。细菌培养 2 天，霉菌培养 5 天后，挑选典型的菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌（108CFU/ml ）和霉菌悬液（1
12、06CFU/ml ） ，置于 4冰箱储藏备用。2.4 一次加菌的 28 天微生物挑战实验量取样品 30ml 分别加 0.3ml 混合菌悬液，使得细菌浓度为 106107CFU/ml，霉菌浓度为104105CFU/ml，充分混匀。将样品在 28 摄氏度下保存，在接菌 0、7、14、21、28d 取样品分析含菌量（培养计数法） 。2.6 评价标准评价标准 一次加菌的 28 天微生物挑战实验防腐效果优良（W） 第 28 天化妆品中存货的细菌数量100CFU/ml，说明该样品防腐体系对细菌有较差的抑杀效果。附：实验中所需的仪器和药品设备名称 需求数量 要求 用途1 冰箱 1 易清洁消毒 存放菌种、标准
13、悬液2 电子秤 1 易清洁消毒 样品重量测试3 浊度仪 1 易清洁消毒 检测细菌菌悬液之浓度4 无菌操作台 1 易清洁消毒 微生物实验用，要求等级 10000 级5 生化培养箱 3 易清洁消毒 细菌、霉菌培养各 1 台；保存琼脂为液体状态及紧急烘干器皿，需用 1 台6 显微镜 1 易清洁消毒 霉菌总数观测用7 移液枪 2 1001000 uL 移取菌液用；备用8 恒温水浴锅 1 易清洁消毒 用于油性样品之充分溶解，规格待定9 自动灭菌锅 1 自动 物品灭菌用10 牛角勺 100 称取样品用；备用11 酒精灯 2 无菌操作台配套用；备用12 200ml 烧杯 10 盛装样品用；备用13 500ml 烧杯 10 盛装样品用；备用14 150ml三角烧瓶10 盛装样品用；备用15 10ml 试管 100 配备塞子 盛装无菌生理盐水；备用16 移液枪枪尖 100 移液枪配套用；备用17 培养皿 200（套） 细菌、霉菌总数测定用；备用18 血细胞计数板 2 霉菌计数用；备用19 革兰氏染色配套盒1 革兰氏染色用20 普通营养琼脂 10 瓶装 自配培养基用；备用21 虎红琼脂 10 瓶装 自配培养基用；备用22 氯化钠 2 分析纯 自配生理盐水用；备用23 硫酸 1 分析纯 用于配置标准悬液24 氯化钡 1 分析纯 用于配置标准悬液25 保鲜膜 2 保存样品用；备用
