1、念珠菌病及实验室诊断,山东省立医院临床微生物学检验科王盛华,概述,念珠菌属（Candida）属于子囊菌亚门子囊菌纲酵母菌目酵母菌科念珠菌属共同特征为细胞呈球形、椭圆形、圆桶形、长条形，有时为不规则形芽殖，除光滑念珠菌外，所有菌种及变种的全部或多数可形成假菌丝，少数可形成厚膜孢子及真菌丝无关节孢子、子囊孢子、冬孢子或掷孢子,概述,Lodder于1970年把念珠菌分成81种及7个变种，此后又陆续发现许多新种，目前至少已达270余种 临床上常见的致病念珠菌有10余种，其中以白念珠菌最为多见，致病力也最强，但其他念珠菌引起深部感染的比例在上升该属能引起从皮肤黏膜甲板到系统内脏血液的广谱病变，是迄今最重
2、要的人类病原真菌,念珠菌病广谱病变,最多见的深部真菌感染 从皮肤粘膜到内脏血液的广谱病变 口腔念珠菌病常是HIV感染的首发症状,念珠菌病来龙去脉,内源性感染：消化道3050 阴道20 咽部14 皮肤2,外源性感染：寄生于水果、奶制品等 性伴传染，母婴传染 院内爆发性传染,念珠菌感染的流行病学,易感因素： 医源性：广谱抗生素、皮质类固醇激素、免疫抑制剂的普遍应用，放疗、化疗、透析技术的广泛开展，器官移植、导管插管、高营养支持、大型手术等新方法推广普及 恶性病：恶性肿瘤、恶性血液病、艾滋病、烧伤、吸毒、糖尿病等 老龄化：人口老龄化的速度在加快,念珠菌感染的流行病学,病原菌和分离率： 过去20年间大
3、量文献报道引起医院真菌感染的主要致病菌为念珠菌属、曲霉属、毛霉属和酵母属 在美国，由念珠菌引起的院内血行感染的发病率1980-1992上升了500% 美国CDC发现医院里最具威胁性的病菌是念珠菌，占医院真菌感染的80% ；国内报告为74.5%，亦有报道为96.09% 在念珠菌中，白念所占的比重逐渐下降，近平滑、热带、光滑和克柔的感染率在较快上升,念珠菌病的临床表现,浅部念珠菌病 皮肤念珠菌病 粘膜念珠菌病 甲念珠菌病 慢性皮肤粘膜念珠菌病 特殊宿主浅部念珠菌病,深部念珠菌病 内脏念珠菌病 中枢念珠菌病 播散性念珠菌病,皮肤念珠菌病,皮肤念珠菌病,粘膜念珠菌病,甲念珠菌病,慢性皮肤粘膜念珠菌病,
4、特殊宿主的浅部念珠菌病,80%以上HIV阳性的患者在整个疾病过程中的某个阶段会出现口腔念珠菌病，念珠菌感染是机会真菌病中最常见的一种 在AIDS中显得优为突出，除了合并皮肤、口腔浅部念珠菌感染外，还可引起食道念珠菌病 可出现体重减少，倦怠感，非特异的消化系统症状主要有咽下困难，胸骨后疼痛 诊断可进行白念珠菌分离。AIDS早期诊断依据中，本症占很重要的位置,特殊宿主的浅部念珠菌病,据国际研究和临床经验，在艾滋病发病前14年内，大多数艾滋病患者都会单独出现口腔症状 与HIV感染密切相关的口腔病变有以下几种： 发生于上腭及舌背，在红色区域上有时可见白色斑点或斑块 或者发生在口腔的任何部位，表现为白色
5、或黄色斑点或斑块，斑块可以擦去，留下红色区域并伴有出血 有人认为口腔念珠菌感染和毛状白斑可作为艾滋病的预测性指标,内脏念珠菌病,念珠菌性肠炎 念珠菌性支气管炎 念珠菌性肺炎 念珠菌性泌尿道炎 其他 食道炎、心内膜炎、脑膜炎、败血症等 亦可侵犯肝、脾等其它内脏,中枢念珠菌病念珠菌脑膜炎,儿童比较多见，常继消化道或呼吸道感染经血循环或通过静脉插管引起 临床有脑膜刺激症，但视乳头水肿及颅压增高现象不明显，脑脊液细胞计数不高，糖稍低或正常，但蛋白升高 除白念珠菌外，热带、克柔和近平滑念珠菌也可引起,播散性念珠菌病,念珠菌血症 急性播散性念珠菌病 慢性播散性念珠菌病,念珠菌败血症,在重症患者中，肠道念珠
6、菌可进入血循环引起血行播散，最常引起肺或肾念珠菌病。患者可有畏寒发热，血培养阳性，特别在感染后2448小时，但数日后转为阴性；如持续阳性，预后不佳 患者可并发内眼炎，两眼疼痛，视力模糊，眼底显示棉球状改变。致病菌多为白念珠菌，少数 （25）为热带念珠菌 临床上有时表现多系统病变，但血培养阴性（阳性期已过），尿阳性，可借以诊断为播散性念珠菌病,念珠菌菌血症和其他,由于长时间静脉补液，尤其是超过20天者易引起念珠菌菌血症，血培养可以阳性，但24小时后转阴，症状较轻，可自愈，亦可恶化，视机体抵抗力而定 其他：如局灶性肝念珠菌病、骨和关节念珠菌病、念珠菌甲状腺炎、腹膜炎、前列腺炎等都有报告,播散性念珠
7、菌病的皮肤表现,播散性念珠菌病内眼炎,念珠菌病的实验室诊断,直接镜检培养鉴定免疫学技术分子生物学技术,直接镜检,培养鉴定,培养基：沙氏培养基温度：25-3024-48小时显色培养基：CHROMagar,培养鉴定,1. 白念珠菌菌落SDA 25中等速度生长酵母样菌落奶油样、光滑、闪光，老后有皱褶显微镜真菌丝和假菌丝芽生孢子假菌丝连接处：簇状、葡萄状小分生孢子顶端或侧枝：厚壁孢子显色培养基：蓝绿色、翠绿色,培养鉴定,2. 热带念珠菌菌落SDA 25中等速度生长光滑、乳白色奶油样菌落陈旧菌落有皱褶显微镜假菌丝孢子稍长假菌丝连接处：小分生孢子显色培养基：蓝灰色、暗蓝色,培养鉴定,3. 近平滑念珠菌菌落
8、SDA 25中等速度生长光滑、柔软陈旧菌落奶油样、白色、闪光、有时黄色、平滑或有皱褶显微镜假菌丝孢子卵圆形或长倒卵形假菌丝连接处：小分生孢子显色培养基：淡粉色、白色,培养鉴定,4. 克柔念珠菌菌落SDA 25中等速度生长扁平、柔软、光滑陈旧菌落污黄色，可有皱褶显微镜假菌丝孢子卵圆形，有的较长假菌丝连接处：小分生孢子显色培养基：淡粉色、紫色,培养鉴定,5. 光滑念珠菌菌落SDA 25中等速度生长光滑、柔软、闪光、奶油样菌落显微镜CMA 25 无假菌丝孢子卵圆形显色培养基：白色、粉紫色,快速鉴定工具,免疫学技术,念珠菌抗体的检测对诊断深部念珠菌病有一定作用 所有怀疑念珠菌深部感染的病例均应做血清学
9、检查，但对结果要有合理解释 单独一次沉淀试验阳性结果并不能建立诊断，因为用表面抗原和菌体抗原不能区分是深部感染产生的抗体还是黏膜寄生或感染产生的抗体； 一次沉淀试验阴性结果并不能除外免疫低下患者念珠菌感染的诊断，因为这种患者常不能产生可检出的免疫学应答 因此，血清学检测在定期、间隔、连续进行时最有价值,免疫学技术- (1-3 )-D-葡聚糖检测（G试验 ）,真菌细胞壁成分，占50%以上；具真菌特异性 只能用于检测有无真菌成分而不能确定是哪种真菌 除隐球菌和某些接合菌外大多数真菌共有成分，主要用于念珠菌和曲霉感染的诊断 敏感性及特异性在78100%之间，阳性预测值较低，阴性预测值高 与GM试验联
10、合应用可提高阳性率 连续2次阳性才能作为诊断依据，具体的判定界值尚不统一（50pg/ml？) 尚需要进一步的多中心前瞻性研究,免疫学技术- (1-3 )-D-葡聚糖检测（G试验 ）,G试验的假阳性问题以下情况可出现假阳性： 使用纤维素膜进行血透，标本或患者暴露于纱布或其他含有葡聚糖的材料 静脉输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品 链球菌血症 操作者处理标本时存在污染 另外，使用多糖类抗癌药物、放化疗造成的粘膜损伤导致食物中的葡聚糖或定植的念珠菌经胃肠道进入血液等也可能造成假阳性,免疫学技术半乳甘露聚糖(GM )检测,GM试验检测的是半乳甘露聚糖，主要适于侵袭性曲霉菌感染的早期诊断，也可用
11、于念珠菌等感染的辅助诊断 GM释放量与菌量成正比，可以反映感染程度。连续检测GM可作为治疗疗效的监测 在造血干细胞移植患者中的诊断敏感性高 以下情况可出现假阳性：使用使用半合成青霉素尤其是哌拉西林/他唑巴坦；新生儿和儿童；血液透析；自身免疫性肝炎等；食用可能含有GM的牛奶等高蛋白食物和污染的大米等 以下情况可出现假阴性：释放入血循环中的曲霉GM（包括甘露聚糖）并不持续存在而是会很快清除；以前使用了抗真菌药物；病情不严重；非粒细胞缺乏的患者连续2次0.5或单次0.7判为阳性,分子生物学技术,分子生物学技术,分子生物学技术,DNA序列数据处理序列片段联接和正反链校正 常用软件 Lasergene
12、(DNAStar) (http:/ DNASIS (http:/ Sequencher (http:/ BioEdit (免费软件, http:/www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html) 从国际核酸序列数据库(GenBank/DDBJ/EMBL)中搜索 (BLAST)和下裁同源序列 多序列比对(align) 常用软件 Clustal W或Clustal X (免费软件) (http:/www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalX/Top.html),参考：,王端礼. 医学真菌学实验室检验指南M（北京大学第一医院皮肤科）刘维达. 念珠菌感染及其诊断.ppt（中国医学科学院皮肤病研究所）白逢彦.深部念珠菌病实验诊断.ppt（中国科学院微生物研究所，真菌学国家重点实验室）,Thank You！,
