1、 酵母 RNA 的提取紫外吸收法测 RNA 浓度实验报告一、实验目的1、掌握稀碱法提取酵母 RNA 的原理和方法。 2、掌握紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理。 3、熟悉紫外分光光度计的使用方法。 二、实验原理核酸是生命的最基本物质之一，广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内。对核酸的研究是更深入研究生命体的基本前提之一。研究核酸需要纯度很高的核酸，所以核酸的提取方法也就在生物学研究中相当重要。本次实验提取酵母的核糖核酸（RNA） 。RNA 离体后稳定性很差，含量低，所以在提取的时候就要注意防止核酸的降解和变性，防止过酸、过碱、避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止 RNA 酶的作用。本实验是医药卫
2、生领域与大工业生产的基础方法。核酸（RNA）都是由核苷酸组成的多聚核苷酸化合物，而核苷酸是由糖、碱基和磷酸以等分子比例构成的，故测定组成核苷酸的任意一种组分即可以测定生物体内核酸的含量或者是提取出来的核酸的含量。 提取 RNA 的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。前者是利用碱使细菌细胞壁溶解，是 RNA 释放出来，后者是在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的通透性，使 RNA 释放出来。使用浓盐法提取 RNA 的时候应该注意掌握温度，直接至 90100浸提，避免在 2070的时间过长，因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶的作用活跃的温度范围，会使 RNA 降解而降低提取率。这两种方法
3、是从废弃的啤酒酵母中提取 RNA 的一般方法。但是这两种方法各有利弊，如浓盐法提取的 RNA 纯度高，而稀碱法提取的时间短，提取率高，更利于工业化生产。RNA 在 260nm 处有最大吸收峰，一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比，故可以用紫外分光光度计通过比色来测定 RNA 含量。 由于蛋白质在 280nm 波长处也有光吸收，对 RNA 测定有一定的干扰作用，但蛋白质的最大吸收峰在 280nm 处，如同时测定 280nm 的光吸收，通过计算可消除其对 RNA 测定的影响。因此如其中含有蛋白质时必须同时测定 280nm 和 260nm的吸光度，可通过计算测定溶液中 RNA 的含量。三、实验器材电子
4、天平、离心机、量筒、烧杯、锥形瓶、紫外分光光度计、容量瓶（100mL） 、移液管（5ml） 、试管和试管架、PH 1-14 试纸四、实验试剂0.2%NaOH、酸性乙醇（5mlHCl 加入剂、500ml 95% 乙醇） 、95%乙醇、无水乙醇、酵母粉、第一次实验所提取的酵母 RNA、标准 RNA 液（100ug/ml） 、0.2%NaoH 溶液、蒸馏水 五、实验步骤1、称取 4g 干酵母粉，放入 200ml 锥形瓶中，加入 40ml0.2%NaOH，沸水浴30 分钟，后流水冷却。将冷却后的液体倒入离心管中，离心 15 分钟，4000 转/min。留上清液，加入 95%酸性乙醇溶液 40ml，边加
5、边搅拌，再 4000 转/min离心 5min。保留沉淀，用 10ml95%乙醇洗沉淀两次，每次洗后离心 3000 转/min，5 分钟。洗完后，再用 10ml 无水乙醇分别洗涤两次，每次洗后离心5min，3000 转/min。最后，收集沉淀于滤纸上，保存备用。2、称取 0.2460gRNA 于 100ml 烧杯中，加 2ml0.2%NaOH 和 1mlH2O 溶解，调成糊状，加入 50ml 左右水，边溶解边用 0.2%NaOH 调 PH 至 7.0，后定容至100ml 混匀。3、取 2ml 定容后溶液再定容至 100ml，按表 1.所示分别向试管中加入定量试剂，混匀，用紫外分光光度计 260
6、nm 紫外线测吸光度其并记录表格4、重复步骤 3.5、再一次重复步骤 3.表 1.六、实验结果表 2.根据表 1.表 2.绘制出标准曲线紫外线测 RNA 浓度标准曲线 0 5 10 15 20 25 30 35 40 4500.10.20.30.40.50.60.70.80.91260nm吸 光 度Linear (260nm吸 光 度)260nm吸 光 度样品平均吸光度为 0.707通过标准曲线可得到稀释后样品浓度为 30.739g/ml所得样品 RNA 百分含量 = =62.48%七、分析与讨论1、在使用离心机时，离心管要对称放置，而且对称的离心管重量也要相同，否则会对离心机造成毁坏。2、提
7、取 RNA 最后在用酒精洗涤沉淀时，要充分混匀，提高提取的 RNA 的浓度。3、根据理论在 5-45g/ml 与吸光值成正比，而该范围的两个端点没有取到，这样所得到的标准曲线的范围变小，而且可能会有一定偏差，进而可能导致实验结果出现误差。4、用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，具有简单、快速、灵敏度高的优点，但是待测核酸样品中含有的微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质时，会产生较小测定误差。由于蛋白质在 280nm 波长处有光吸收，如果同时测定280nm 的光吸收，通过计算可消除蛋白质对 RNA 测定的影响，减少实验误差。5、我们组得到的 RNA 的浓度相对来说是较高的，这得益于我们操作过程的更加准确与细心，在测定吸光度时，对没有用手碰触比色皿的光滑一面，保持实验的准确性。
