1、1实验室 主 题 文件编号 F07第 1 页 共 4 页第 1 版 第 0 次修改临沧市第二人民医院检验科分子生物实验室标本处理（核酸纯化）标准操作程序 撰写日期：2015.11.201 目的：保证标本处理标准化、规范化，使不规范操作因素对实验结果造成的影响减至最小。2 适用范围：乙型肝炎病毒核酸提取、解尿支原体核酸提取、沙眼衣原体核酸提取、HPV 核酸提取、HCV 核酸提取、结核杆菌核酸提取、淋球菌核酸提取。3 操作人：李成庭、李丽蒙、高子文 李华娇 张国华4 标准操作程序4.1 乙型肝炎病毒（DNA 血清）1）双手戴上手套，从冰箱取出标本，将离心管依次编号。2）取出 1.5ml 离心管，对
2、应标本编号，置于离心管架上。3）将移液器调到 70l，先混匀 DNA 提取液，再吸取 70l 加入到已编号的离心管中。然后吸取 30l 血清，加入离心管中混匀，注意每吸取一份血清标本应更换一次枪头。处理全部标本，然后将离心管插到金属浴孔内，100加热 10 分钟。4）裂解完成后将离心管取出，然后 10000rpm 离心 5 分钟，取上清液 20l 加样上机。5）收拾台面至准备状态。4.2 CT、UU、NGH DNA（分泌物）1）双手戴上手套，从冰箱取出标本，将化验单和离心管依次编号。2）双手换上新手套，取出 1.5ml 灭菌离心管，对应标本编号，置于2离心管架上。3）向有棉拭子的离心管中加入
3、2ml 无菌生理盐水，振荡混匀，将混悬液用移液器吸取 1.0ml 加入到已编号的离心管中。10000rpm 离心5 分钟，弃上清液，留取沉淀加 50 微升 DNA 提取液混匀，金属浴100加热 10 分钟。4）裂解完成后取出离心管，然后 10000rpm 离心 5 分钟，取上清液2l 加样上机。5）收拾台面至准备状态。4.3 结核杆菌（DNA 痰液、胸腹水等）1）双手戴上手套，从冰箱取出标本，将化验单和离心管依次编号。2）双手换上新手套，取出 1.5ml 灭菌离心管，对应标本编号，置于离心管架上。3）用移液器吸取 4 倍体积 4%NaOH 到痰液容器，液化 30 分钟，用移液器调吸取 1ml
4、加入到已编号的离心管中，然后 10000rpm 离心 5 分钟，弃上清，留取沉淀，用无菌生理盐水洗涤两次，沉淀加50ulDNA 提取液，充分震荡混匀。胸腹水、脑脊液直接混匀后，用移液器调吸取 1ml 加入到已编号的离心管中，然后 10000rpm 离心 5分钟，弃上清，留取沉淀，加 50ulDNA 提取液，充分震荡混匀。然后将离心管插到金属浴孔内，100加热 10 分钟。4）裂解完成后将离心管取出，然后 10000rpm 离心 5 分钟，取上清液 2l 加样上机。5）收拾台面至准备状态。34.4 丙型肝炎病毒 RNA（血清）1) 双手戴上手套，从冰箱取出标本，将离心管依次编号。2）取出 1.5
5、ml 灭菌离心管，对应标本编号，置于离心管架上.3)1.5ml 无菌管加入 50ul 蛋白酶 K200ul 血清200ul 裂解液混匀 72加热 10min（同时将洗脱液 72预热）加入 250ul 无水乙醇将混合液全部吸至离心柱 12000rpm/1min将离心柱装在新的收集管中加 500ul 抑制物去除液 12000rpm/1min将离心柱装在新的收集管中加 500ul 去离子液 12000rpm/1min将离心柱装在新的收集管中再加 500ul 去离子液 12000rpm/4min将离心柱装在 1.5ml 的离心管中，开盖 72/2min在离心柱正上方加入 72预热的洗脱液 35ul,盖
6、盖 14000rpm/1min,离心管内即病毒核酸溶液，最好立即使用，如需保存，置-20。注：配试剂蛋白酶 K+1.375ml 洗脱液，混匀，-20保存CarrierRNA+110ul 内标液混匀，-20保存去离子浓缩液+44ml 无水乙醇裂解工作液:1 人份病毒裂解液 200ul+ CarrierRNA4ul,现用现配（根据标本数依次增加） 。PCR 试剂 HCV 反应液 A-2ul, HCV 反应液 B-3ul,HCV 反应液 C-25ul混匀（根据标本数依次增加） 。4.5 乳头瘤病毒 DNA（宫颈样本）1) 双手戴上手套，从冰箱取出标本，将离心管依次编号后。42）取出 1.5ml 灭菌离心管，对应标本编号，置于离心管架上.3）向有样本刷的离心管中加入 2ml 无菌生理盐水，振荡混匀，将混悬液用移液器吸取 1.0ml 加入到已编号的离心管中。10000rpm离心 5 分钟，弃上清液，留取沉淀加 50 微升 DNA 提取液混匀，金属浴 100加热 10 分钟。裂解完成后将离心管取出，然后 10000rpm离心 5 分钟，取上清液 5l 加样上机。起 草 人 校 对 人 批 准 人 生效日期李丽蒙 高子文 李成庭 2015.11.255标本处理（核酸纯化）标准操作程序
